Следствие ведет ВироСкан

Мария Валиева, «Биомолекула»

Разработан метод глобального сканирования иммунитета на присутствие в крови человека всевозможных противовирусных антител. Что это нам дает? Ученым-иммунологам – интересные фундаментальные знания и перспективные направления исследований. Практикующим врачам – почву для размышления и помощь в работе. А эта статья посвящена принципу нового подхода.

Не вызывает сомнений важность диагностики вирусных заболеваний человека: хронических, острых и даже давно перенесенных. Для успешного лечения людей нужно понимать, к каким вирусам у организма выработался иммунитет. Посредником между клетками иммунной системы и патогенами служат антитела – специальные белковые молекулы, помогающие узнавать чужеродные объекты, проникшие в организм. (Исследования иммунитета – одни из самых востребованных и перспективных в наши дни. С их помощью разрабатывают лекарства нового поколения – «Вирус Эбола и макак-резус: получено новое эффективное лекарство» [2], и за них же дают Нобелевские премии – «Иммунологическая Нобелевская премия (2011)» [3] – Ред.). Иммунный ответ человека обычно развивается в течение 10-14 дней после контакта с инфекцией [1], а «память» о нем часто сохраняется долгие годы. Она остается в виде антител, которые циркулируют в крови. Таким образом, изучая иммунную систему, можно не только установить, какими вирусами заражен человек в настоящее время, но и узнать, какие инфекции он уже перенес.

Почему на здоровье людей могут влиять их виромы – совокупности всех тех вирусов, что сумели заразить индивидуума? Во-первых, вирусы могут вызывать острые и хронические заболевания. Во-вторых, они оставляют след в иммунной системе и даже иногда положительно влияют на нее: стимулируя, помогают бороться с другими патогенами. Взаимодействия вирома и иммунитета бывают вовлечены и в развитие многофакторных заболеваний, таких как диабет первого типа, воспаление кишечника и астма. (ВирОм, генОм, транскриптОм... О типах крупномасштабных объектов изучения в современной биологии, то есть об -омах и -омиках, читайте в статье «„Омики“ – эпоха большой биологии» [4]. – Ред.)

До сих пор врачи и ученые анализировали противовирусный иммунитет человека, используя индивидуальный подход – целенаправленно искали антитела против конкретного вируса, проверяя клиническую гипотезу. Однако не лишне было бы иметь метод, позволяющий находить все противовирусные антитела человека одновременно, в высокопроизводительном формате. Большая международная команда ученых разработала такой подход [5].

Новый метод назвали ВироСкан (VirScan), и он делает возможным расширенный анализ антител к широкому спектру вирусов в сыворотке крови человека. Этот подход способен регистрировать иммунный ответ на все вирусы человека одновременно и призван помочь установить связь между перенесенными вирусными инфекциями и текущими болезнями, а также популяционными особенностями. Итак, каков же принцип работы ВироСкана?

Белки вирусов человека при попадании в организм узнаются иммунной системой. ВироСкан ищет антитела к таким белкам в сыворотке крови – «следы» первичных контактов. Добиться этого можно следующим образом. Ген, кодирующий вирусный белок (главный вирусный антиген), методами генной инженерии помещают в бактериофаг. Причем эту вставку делают не в произвольное место фагового генома, а в такое, чтобы синтезированный белок был экспонирован на поверхности вирусной частицы – только в этом случае произойдет распознавание белка иммунной системой. Создается целая «библиотека» таких бактериофагов, несущих на своей поверхности антигены множества вирусов, а дальше остается всего лишь добавить капельку крови (рис. 1). Присутствующие в крови антитела связывают белки только тех вирусов, к которым у донора крови есть иммунитет. Далее из системы извлекают все антитела и смотрят, что с ними связалось. ДНК «избранных» антителами бактериофагов секвенируют [6, 7] и узнают, какие же «чужие» вирусные белки были в ней закодированы, а следовательно, к каким вирусам у донора есть иммунитет.

Рисунок 1. Метод единовременного определения антител ко всем известным вирусам человека – ВироСкан. 

а – Принцип метода. Каждый ряд – определенный вирус, столбец – образец крови; цвет ячейки отражает относительное количество пептидов вируса (антигенных эпитопов), выявленных с помощью антител. 

б – Этапы. Подход основан на сочетании производства ДНК-микрочипов, фагового дисплея, иммунопреципитации и секвенирования ДНК (технология phage immunoprecipitation sequencing – PhIP-seq). 

Рекомбинантные бактериофаги Т7, собранные в библиотеку, несут на своей поверхности различные пептиды (по 56 аминокислот) вирусов человека, а антитела (Ат) из крови донора связывают эти белки – если иммунной системе доводилось ранее сталкиваться с соответствующим вирусом. Секвенируя амплифицированную ДНК бактериофагов, связанных с антителами, можно понять, что за пептиды были на их поверхности, и восстановить спектр вирусов, к которым у донора крови есть иммунитет. Рисунки из [5], адаптированы.

Для такого анализа достаточно всего одного микролитра (!) крови. Ученые полагают, что если процедуру анализа вирома поставить на поток, то ее удастся удешевить до $25 за пробу. Важно отметить, что с открытием новых вирусов их будет довольно легко включить в библиотеку. Контакты с другими патогенами (грибами, бактериями, простейшими) тоже можно отслеживать подобным образом.

Во время тестирования ВироСкана ученые проанализировали сыворотку крови 569 человек из четырех стран, расположенных на разных континентах. При этом ученые столкнулись более чем с 108 взаимодействиями пептид-антитело, проанализировали 206 видов и более 1000 штаммов вирусов человека. Характеристики нового подхода оказались обнадеживающими. ВироСкан сравнивали с другими коммерческими методами определения вирусных инфекций (например, иммуноферментным анализом (ИФА, ELISA)), и он показал высокую эффективность: специфичность и чувствительность ВироСкана превысили для большинства вирусов 95%, метод оказался способным различить даже близкородственные вирусы.

Убедившись, что метод работает, ученые решили проанализировать, с какими вирусами сталкиваются люди из разных стран. Оказалось, что в среднем человек имеет иммунитет к 10 вирусам из 206 исследованных, но были и уникальные случаи. Пять человек оказались обладателями антител к 62 вирусам, а двое – к 84! Как и ожидалось, к широко распространенным агентам (вирусу Эпштейна-Барр (ВЭБ) и другим герпесвирусам, рино- и аденовирусам) устойчивость у взрослых регистрировали часто, а к редким вирусам – нет.

ВироСкан также позволяет определить, какие прививки делали испытуемые. Однако оказалось, что антитела к вирусам гриппа (A и B) и полиовирусу встречаются реже, чем можно предположить исходя из того, сколько людей переносит соответствующие инфекции или вакцинируется. Видимо, это связано с тем, что гуморальный иммунитет (B-клеточная память) к таким возбудителям постепенно ослабевает, так как они не присутствуют в организме постоянно.

Ученые сравнивали профили антител людей из США, Перу, Таиланда и Южной Африки. В среднем доноры не из США имели больший набор противовирусных антител, зато жители Штатов отличались повышенным содержанием антител к относительно редкому вирусу гриппа типа B – благодаря вакцинации. Были и «справедливые» инфекционные агенты, которые равномерно заражали людей во всех регионах, – такие как риновирусы и ВЭБ.

Авторы работы обратили внимание на интересный момент: В-клетки памяти, обнаруживаемые у разных людей, как правило, производят одинаковые антитела против какого-либо вируса. То есть, даже если белок вируса большой и может узнаваться иммунной системой в нескольких местах, антитела нарабатываются преимущественно к самому иммуногенному фрагменту белка. Это говорит о том, что В-клеточный ответ людей очень стереотипен. Однако выбор иммуногенного пептида отличается у людей с разных континентов. Причиной может быть то, что сами вирусы немного отличаются в разных уголках мира.

Итак, с помощь нового подхода уже удалось описать иммунный ответ большой группы людей. Предварительные исследования выявили интересные общие свойства человеческой иммунной системы и некоторые географические и возрастные особенности ее ответа на вторжение вирусов. ВироСкан может стать важным инструментом для понимания взаимоотношений хозяин-вирус, их влияния на здоровье и развитие болезней – даже на первый взгляд с вирусной инвазией не связанных.

Литература

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru

30.06.2015