Секвенирование ДНК: дёшево или точно?

ДНК-секвенаторы: точность против простоты и дешевизны

Кирилл Стасевич, Компьюлента

Хотя секвенировать ДНК научились давно, исследователи не перестают искать новые методы и оптимизировать старые. Цель таких работ – удешевить процесс, сделать его быстрым, простым и точным, чтобы в прочитанной последовательности ДНК можно было быть уверенным с первого раза.

И, как и во всяком научном деле, успехи тут не обходятся без неудач, более или менее тяжёлых. Бывает, что исследователям просто не удаётся взять ту планку, которую они сами себе поставили: например, точность метода повышается, но не так быстро, как нам хотелось бы. Что-то похожее произошло с компанией Oxford Nanopore Technologies, два года назад заявившей о довольно необычном способе секвенирования, с которого можно было бы единовременно прочитывать очень большие куски ДНК.

Говоря о секвенировании ДНК, нужно понимать, что это не означает непрерывного чтения всей молекулы ДНК, которая составляет бактериальную или, тем более, человеческую хромосому. Существует много методов сиквенса, но в каждом из них на выходе получается набор коротких прочитанных последовательностей, которые укладываются в исходную большую ДНК. Эти мелкие фрагменты можно объединить благодаря их взаимному перекрыванию, то есть всё ещё зависит от того, насколько точно считаны маленькие фрагменты и насколько точно удалось их совместить.

Подключённый к ноутбуку аппарат для секвенирования MinION (фото Oxford Nanopore Technologies).

Суть же процедуры, предлагаемой Oxford Nanopore, заключалась в следующем: ДНК протягивали через пору, при этом ДНК меняла ионный поток в этой поре, и такие изменения зависели от того, какой нуклеотид в текущий момент проходит через пору. В теории такой способ позволил бы за раз прочитывать тысячи нуклеотидов, без последующей манипуляции с фрагментами последовательности. Идее уже двадцать лет, но реализовать технически её удалось только в 2012 году.

Авторы метода тут же собрались поставить его на поток. Но, во-первых, оказалось, что ту мембрану, через которую они пропускали ДНК в экспериментах, в больших количествах изготавливать сложно – и ей пришлось искать замену. Во-вторых, видя энтузиазм, который их метод возбудил в биомедицинской общественности, учёные попытались изготовить портативный прибор, доступный всем и каждому, в котором просто нужно было бы менять расходные материалы.

Два года об этом не было ни слуху ни духу. И вот сейчас на конференции Advances in Genome Biology & Technology http://agbt.org/about.html, которая проходит во Флориде (США) и на которой сообщают о последних достижениях в геномных технологиях, с известиями о новом методе выступил Дэвид Яффе (David Jaffe) из Института Броуда (США), сотрудничающий с Oxford Nanopore. Как выяснилось, ожидания, касающиеся «метода наноотверстий», оказались в известной степени завышенными: с его помощью можно было читать куски длиной в 10 000 азотистых оснований (действительно огромная длина), однако в прочитанных кусках неизбежно появлялись ошибки, которые не позволяли сложить из них полный геном (эксперименты ставились с ДНК кишечной палочки длиной 4,6 млн пар оснований и с ДНК Scardovia wiggsiae длиной 1,55 млн пар оснований). Чтобы объединить фрагменты в геном, нужны были данные, полученный с помощью другого метода сиквенса – например, того, что используется в машинах фирмы Illumina.

Секвенирующая машина фирмы Illumina (фото Illumina).

Метод Illumina (точнее, Illumina/Solexa) заключается в том, что на ДНК-шаблоне, который нужно прочитать, синтезируется комплементарная цепь из нуклеотидов с флюоресцентной меткой. После встраивания нуклеотида в растущую цепь его свечение считывается, и таким образом можно узнать, что за нуклеотид встал на очередную позицию (у всех четырёх нуклеотидов светящиеся метки различны). Здесь, можно сказать, последовательность в буквальном смысле читается, и общая картина складывается из множества прочитанных фрагментов длиной примерно в сто нуклеотидов.

Как мы помним, одним из важных критериев метода секвенирования является его дешевизна (чем дешевле процедура, тем больше клиник смогут себе его позволить). В этом году Illumina заявила, что ей удалось снизить «стоимость» одного человеческого генома до 1 000 долларов (куда входят и реагенты, и труд оператора) – однако проблема её машин в том, что сами по себе они исключительно дороги, и, чтобы окупиться, такой агрегат должен обработать за год 1 800 геномов. Далеко не каждая медицинская организация имеет дело с такими масштабами, так что компания пока что всё равно работает на биомедицинские гиганты и масштабные проекты.

Но вернёмся к аппарату Oxford Nanopore, который был назван MinION. Его авторы не унывают, предлагая всем желающим испытать его за 1 000 долларов, которые, если результат не понравится, вернут обратно. Считается, что он пригодится при грубом анализе бактериальной микрофлоры (к примеру, в почве) или при анализе ДНК, содержащейся в пище. Однако весь вопрос в том, насколько его возможности окажутся полезны в каждом случае: многие исследователи усомнились в перспективах этого портативного секвенатора, раз уж его данные всё равно надо подкреплять другим методом.

Ну а мораль, которую можно вывести из этой истории, заключается, видимо, в следующем: секвенаторы ДНК не скоро станут такими же доступными, как утюг или стиральная машина. Если, конечно, мы хотим от таких аппаратов исчерпывающих и точных результатов.

Подготовлено по материалам ScienceNOW: DNA Sequencing Firm's Second Act Gets Mixed Reviews.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
18.02.2014