Подписаться на новости
  • Сенатор
  • ООО "Ай Вао"
  • mmif-2019
  • biokhaking
  • techweek

Геномная хирургия

В течение последнего десятилетия по мере усовершенствования и удешевления технологии секвенирования ДНК происходило стремительное углубление человека в секреты его собственного генома. Однако до недавнего времени попытки ученых прицельно модифицировать гены в живой клетке не давали желаемых результатов. В качестве примера можно привести серповидноклеточную анемию. Это тяжелое и часто фатальное заболевание вызывается мутацией одной из трех миллиардов пар нуклеотидных оснований ДНК пациента. Данная генетическая ошибка очень проста и хорошо изучена, но, несмотря на это, исследователи долгое время были бессильны в попытках исправить ее и устранить вызываемые ею губительные эффекты.

Однако последние достижения в области геномной инженерии вселяют надежду. Одной из наиболее многообещающих является технология CRISPR. Она позволяет проводить микрохирургические операции на генах, изменяя последовательность ДНК в строго определенных регионах хромосомы. Наряду с изобретенной несколько лет назад технологией TALENs, а также ее предшественником, использующим белковые комплексы, известные как «цинковые пальцы», CRISPR может расширить сферу применения генной терапии и обеспечить возможность излечения простых генетических заболеваний, таких как серповидноклеточная анемия, а в будущем – и более сложных патологий, затрагивающих сразу несколько генов. Большинство традиционных геннотерапевтических подходов заключаются во встраивании нового генетического материала в геном клетки случайным образом и позволяют только добавить целый ген. CRISPR, а также другие новые технологии, напротив, дают ученым возможность с высокой точностью редактировать конкретные фрагменты ДНК, вплоть до замены одной пары нуклеотидных оснований. По сути, они позволяют переписать человеческий геном по желанию.

Конечно, до внедрения этих подходов в клиническую практику пройдет еще не один год, однако исследователи уже достигли определенного успеха в предварительных экспериментах, посвященных разработке методов лечения серповидноклеточной анемии, ВИЧ и муковисцидоза (таблица 1). Один из них, Ган Бао (Gang Bao) из Технологического института Джорджии, успешно использовал CRISPR для коррекции мутации, вызывающей серповидноклеточную анемию, в ДНК выращиваемых в культуре клеток человека. Его группа в 2008 году начала работать с технологией «цинковых пальцев», после чего переключилась на TALENs, а впоследствии – на CRISPR. Бао надеется в будущем расширить область своей работы на другие заболевания, однако считает, что серповидноклеточная анемия является идеальным объектом для отработки подхода, так как это заболевание вызывается однонуклеотидной мутацией в одном гене и затрагивает клетки одного типа.

На сегодняшний день единственным эффективным методом лечения серповидноклеточной анемии является трансплантация костного мозга, проведение которой возможно только при наличии у пациента здорового совместимого донора. Однако даже в этом случае существует большой риск гибели пациента от развивающихся иммунологических реакций и других побочных эффектов.

Разрабатываемый Бао подход позволит избежать подобных неприятностей. Он подразумевает выделение из костного мозга пациента гемопоэтических стволовых клеток, коррекцию их генома с помощью CRISPR и введения обратно пациенту. Такие «исправленные» клетки будут делиться и дифференцироваться в нормальные эритроциты. Даже если таким образом удастся заменить 50% пораженных заболеванием эритроцитов, пациент будет чувствовать себя намного лучше, а замена 70% аномальных клеток полностью излечит его.

Несмотря на то, что технологии CRISPR всего лишь немногим более года, она уже преобразила направление генетических исследований. Ученые получили возможность быстро и одновременно вносить несколько изменений в геном живых клеток. В развитие многих заболеваний человека, в том числе болезней сердца, сахарного диабета и различных неврологических патологий, вовлечены множественные варианты как патологически измененных, так и нормальны генов. Изучение этих сложных взаимодействий на животных моделях является очень медленным и малоэффективным процессом. При использовании традиционных генетических методов на создание генетически модифицированной мышиной модели с одной мутацией может уйти год. Если исследователям нужна животная модель с несколькими мутациями, генетические изменения приходится вносить последовательно, что растягивает эксперимент на несколько лет. CRISPR позволяет создавать такие модели за несколько недель.

Таблица 1.

 

Методы коррекции

 

Нуклеазные комплексы «цинковые пальцы»

TALENs

CRISPR

Что это такое?

Белковый комплекс, состоящий из разрезающего ДНК фермента нуклеазы и связывающегося с ДНК региона, распознающего ген-мишень.

Также белковый комплекс, состоящий из разрезающего ДНК фермента нуклеазы и связывающегося с ДНК региона, распознающего ген-мишень, однако его синтез гораздо проще, чем синтез комплекса «цинковые пальцы».

Разрезающий ДНК фермент, направляемый молекулой РНК, избирательно связывающейся с геном-мишенью.

Достоинства и недостатки

Эта технология стала первым программируемым инструментом для коррекции генома, однако она подразумевает использование белков, которые сложно модифицировать для применения с новыми генами-мишенями. Возможно также появление потенциально опасных непреднамеренных разрезов ДНК.

Несмотря на относительную легкость и дешевизну синтеза по сравнению с комплексами «цинковые пальцы», белки TALENs достаточно сложно синтезировать и доставлять внутрь клеток. Также проблемой является возможность непреднамеренных разрезов ДНК.

Данная технология доступна и легка в применении. Она позволяет проводить высокопроизводительные эксперименты по одновременной коррекции нескольких генов. Так же, как и при применении других методов, существует риск непреднамеренных разрезов ДНК.

CRISPR-РНК, с высокой точностью направляющие фермент нуклеазу к месту предполагаемого разрезания ДНК, с легкость можно синтезировать для любого гена-мишени. В декабре 2013 году исследователи Массачусетского технологического института, работающие под руководством Фэна Чзана (Feng Zhang) и Эрика Ландера (Eric Lander), создали библиотеку существующих CRISPR-РНК, каждая из который специфична к определенному гену человека. Эта обширная коллекция, затрагивающая почти все человеческие гены, доступна другим заинтересованным исследователям, что позволит ускорить полногеномные исследования генетики рака и других заболеваний.

Геномный GPS

Генная инженерия возникла в 1973 году, когда Герберт Бойер (Herbert Boyer) и Стенли Коэн (Stanley Cohen) встроили измененную чужеродную ДНК в геном бактерии. В течение нескольких лет была основана компания Genentech, которая начала использовать генетически модифицированную кишечную палочку для производства человеческого инсулина, предназначенного для заместительной терапии сахарного диабета. В 1974 году Рудольф Яниш (Rudolph Jaenisch) создал первую трансгенную мышь с помощью вируса, встроившего в геном животного фрагмент ДНК другого вида. Однако в этих и других примерах ранней генной инженерии возможности исследователей были ограничены методиками, встраивающими чужеродную ДНК в геном клетки-мишени случайным образом. То есть ученым оставалось только полагаться на удачу.

Молекулярным биологам потребовалось более двадцати лет для того, чтобы научиться эффективно изменять определенные гены в ДНК животных. Дана Кэрролл (Dana Carroll) из университета Юты предположила, что синтезированные в 1996 году исследователями университета Джонса Хопкинса содержащие фермент нуклеазу белковые комплексы, получившие название «цинковые пальцы», можно использовать в качестве программируемого инструмента для модификации генов. Один из концов такого комплекса распознает определенную последовательность ДНК, а другой – разрезает ее. Полученный разрез впоследствии восстанавливается с помощью фрагмента чужеродной ДНК. Эта технология позволила ученым осуществлять прицельную корректировку хромосом, однако она оказалась весьма сложной в практическом применении. Для осуществления каждой модификации требуется создание нового белка, специфичного к последовательности-мишени. Эта задача требует много времени и сил, при этом капризные белковые комплексы не всегда работают.

Следующий прорыв в области редактирования генов произошел в 2010 году с появлением технологии TALENs. Этот подход также подразумевает использование белков, находящих и разрезающих определенную последовательность ДНК. Однако их модифицирование для нацеливания на определенную последовательность нуклеотидов значительно проще. Несмотря на существенные преимущества перед «цинковыми пальцами», используемые технологией TALENs белки имеют очень крупные молекулы, с которыми трудно работать, в том числе вводить их внутрь клетки.

Появление CRISPR полностью изменило ситуацию. В этой технологии специфичные к ДНК белки заменены короткими фрагментами РНК, 20-нуклеотидные последовательности которых с легкостью синтезируются в лабораторных условиях.

CRISPR расшифровывается как «clustered regularly interspaced short palindromic repeats» – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами. Эти повторы представляют собой часто встречающиеся в бактериальных геномах короткие последовательности ДНК, одинаково читающиеся в обоих направлениях. Впервые эти повторы были идентифицированы в 1980-х годах, однако только почти 20 лет спустя исследователи установили, что они являются компонентом системы защиты бактериальных клеток. При вирусной атаке бактерия может встраивать вирусную ДНК в своей геном между многократно повторяющимися сегментами. При последующей встрече с этим же вирусом ДНК данных регионов используется для синтеза цепочек РНК, распознающих соответствующие последовательности вирусной ДНК. Прикрепляемый к этим РНК фермент разрезает вирусную ДНК.

В 2012 году Эммануэль Шарпантье (Emmanuelle Charpentier) из Центра по исследованию инфекционных заболеваний им. Гельмгольца и Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna) из университета Калифорнии в Беркли продемонстрировали возможность использования РНК в комплексе с ферментом Cas9 для прицельного разрезания ДНК в растворе. В 2013 году Фэн Чзан и Джордж Черч (George Church) из Гарвардского университета независимо друг от друга опубликовали результаты, доказывающие, что система CRISPR/Cas9 может быть использована для модифицирования генома в клетках млекопитающих, в том числе человека.

Сейчас исследователям, желающим модифицировать какой-либо ген, необходимо только синтезировать фермент Cas9 и фрагмент РНК, соответствующий последовательности нужного региона белка-мишени. РНК направляет фермент к запланированному месту разрезания молекулы ДНК. Так как независимо от мишени используется один и тот же фермент, исследователи могут планировать эксперименты по одновременной коррекции нескольких генов с использованием Cas9 и необходимого количества направляющих РНК.

Сложные загадки

Фэн Чзан, помимо Массачусетского технологического института являющийся сотрудником института Броуда и института изучения мозга имени Макгаверна, заинтересован в генетической подоплеке психических заболеваний. Чтобы разобраться в патогенезе этих сложных патологий, он участвовал в разработке многих инструментов для модификации генов и нейронов, в том числе TALENs и оптогенетики – технологии регуляции активности нейронов с помощью света лазера. Как только в 2011 году до него дошла информация о появлении CRISPR, он начал модифицировать эту методику для применения на человеческих клетках. В настоящее время Чзан использует ее для изучения генетических секретов, скрывающих причины таких тяжелых и плохо изученных заболеваний, как шизофрения и аутизм.

Методика CRISPR позволяет Чзану систематично тестировать варианты ДНК, считающиеся ассоциированными с этими заболеваниями. Несмотря на то, что в течение последнего десятилетия был достигнут значительный прогресс в идентификации генов, часто встречающихся у людей с психическими заболеваниями, ученым не удается разобраться в том, как эти гены взаимосвязаны с их симптомами. По словам Чзана, полученные в результате секвенирования данные по сути являются всего лишь фиксацией наблюдений. Для того, чтобы понять, действительно ли подозреваемый ген вызывает тот или иной симптом, в здоровый организм надо внести соответствующую мутацию и понаблюдать за последствиями. Появление у такой клетки или организма признаков заболевания является доказательством вовлеченности изучаемого гена.

Таблица 2.

 

Путь к излечению

 

Серповидноклеточная анемия

ВИЧ

Муковисцидоз

Стратегия

Коррекция мутации, вызывающей серповидноклеточную анемию, в стволовых клетках, выделенных из костного мозга пациента, и их последующее введение обратно пациенту; в качестве альтернативы можно реактивировать в этих же клетках ген фетального гемоглобина, находящихся в инактивированном состоянии.

Предотвращение инфицирования здоровых иммунных клеток ВИЧ-инфицированных пациентов путем изменения генов клеток-предшественников, используемых вирусом для проникновения внутрь зрелых клеток. В качестве альтернативы можно разрушать неактивные частицы ВИЧ, встроенные в геном человека, путем изменения важных вирусных генов.

Коррекция вызывающих муковисцидоз мутаций в клетках эпителия дыхательный путей и других тканей, страдающих при заболевании клетках.

Статус

Стратегия коррекции эффективно работает на человеческих клетка в лабораторных условиях; для этого с успехом применялись «цинковые пальцы», TALENs и CRISPR. Эффективность стратегии реактивации продемонстрирована на человеческих клетках и мышах с использованием «цинковых пальцев».

Превентивная стратегия с использованием «цинковых пальцев» в настоящее время проходит клинические исследования; эффективность использования TALENs и CRISPR продемонстрирована в лабораторных условиях. Стратегия устранения латентных вирусных частиц с помощью «цинковых пальцев» и CRISPRтакже сработала в экспериментах на клетках.

«Цинковые пальцы» и TALENs с успехом использовались для коррекции вызывающих муковисцидоз мутаций в культурах клеток дыхательных путей; CRISPR использовался для коррекции мутаций в культивируемых органоподобных структурах, выращенных из клеток кишечника.

Чзан может воссоздавать генетические варианты, встречающиеся у людей с аутизмом и шизофренией, в культивируемых клетках человека и в клетках живых лабораторных мышей. Это позволяет создавать мышей, имеющих человеческую мутацию в соответствующем гене и анализировать особенности их поведения и способность к обучению. После этого можно оценить особенности поведения и физиологии культивируемых в лаборатории выращенных из стволовых клеток нейронов, модифицированных той же мутацией.

Чзан также использует CRISPR для одновременного внесения изменений в несколько генов. Эта возможность особенно важна при изучении таких сложных заболеваний, как аутизм и шизофрения, которые, в отличие от серповидноклеточной анемии, не являются результатом одной известной мутации. У разных пациентов болезни развиваются из-за различных комбинаций мутаций. Разгадывание этой чрезвычайно сложной головоломки требует проведения масштабных систематических исследований, посвященных изучению эффектов, оказываемых различными генами и механизмов из взаимодействия. CRISPR делает эту задачу выполнимой.

Дети по индивидуальному проекту

В конце прошлого года Дудна, Чзан, Черч и еще два пионера в области геномной инженерии основали компанию стартап Editas Medicine, деятельность которой посвящена разработке новых методов лечения генетических заболеваний человека. В ноябре компания объявила, что ей удалось собрать 43 миллиона долларов США в качестве венчурного капитала и обнародовала планы по использованию технологий коррекции генома для лечения широкого спектра заболеваний.

Появление Editas Medicine вызвало большой резонанс из-за возрождения интереса к генотерапии, вызванного достижениям последних лет, в том числе разработкой безопасных механизмов доставки генетического материала в клетки. Разрабатываемые компанией методы лечения будут фундаментально отличаться от более ранних подходов, подразумевающих использование вирусов-носителей для доставки терапевтических генов.

По словам Черча, коррекция существующего гена или удаление его фрагмента выходят за рамки возможностей методов, основанных на использовании вирусных векторов. В то же время удаление крошечного участка ДНК может быть гораздо более эффективным, чем встраивание здорового гена. В качестве примера можно привести болезнь Гентингтона. Это фатальное заболевание мозга развивается в результате накопления токсичных белковых агрегатов в нейронах. Введение в геном клеток нормальной копии гена не устраняет синтезируемый клетками токсичный белок. От него можно избавиться только «переписав» исходную версию гена.

Возможности CRISPR не ограничены добавлением недостающего и исправлением ошибок. Черч добавляет, что, когда начинаешь осознавать, что наиболее распространенные версии генов совсем необязательно являются оптимальными, перед глазами открывается гораздо более обширное поле деятельности. Возможно, в будущем специалисты смогут модифицировать нормальные гены таким образом, что человек сможет более эффективно противостоять инфекционным заболеваниям. Теоретически можно даже внести коррекции в молекулярные механизмы процесса старения.

Черч также предсказывает, что если методы коррекции генома будут использоваться для лечения детских болезней, у специалистов появится искушение использовать их для инженерии эмбрионов при проведении экстракорпорального оплодотворения. Эффективность этого подхода уже продемонстрирована в экспериментах на мышиных и крысиных эмбрионах. А в конце января китайские ученые объявили о создании с помощью CRISPR генетически модифицированных обезьян.

Эти возможности не могут не поднимать этических вопросов. Однако если исследователи смогут доказать безопасность избавления от заболеваний путем коррекции генома, у некоторых родителей неизбежно появится желание вмешаться в геномы здоровых эмбрионов. Если генотерапия позволит предотвращать умственную отсталость, неизменно возникнут вопросы по поводу возможности внесения целого спектра интеллектуальных усовершенствований.

По мере расширения области практического применения CRISPR возникновение подобных вопросов неизбежно. Однако на сегодняшний день эта технология находится на стадии разработки. Тогда как исследователи, в том числе Бао, Черч и Чзан, мечтают об избавлении от неизлечимых заболеваний, в реальности они занимаются преимущественно усовершенствованием технологии и изучением ее возможностей. Однако уже сейчас, вскоре после своего появления, технология CRISPR полностью трансформировала взгляд специалистов на возможности коррекции генома и наделила их поистине неограниченными возможностями.

Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам MIT Technology Review: Genome Surgery.

13.02.2014

Читать статьи по темам:

генная инженерия геном человека генотерапия гены мутация наследственные болезни Версия для печати
Ошибка в тексте?
Выдели ее и нажми ctrl + enter
назад

Читать также:

Как белок Cas9 «узнаёт» нужный участок ДНК

Исследователи из Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли установили, как РНК-направляемый фермент Cas9 находит последовательности-мишени из 20 пар нуклеотидов в геноме из миллионов и даже миллиардов пар.

читать

Особо точная генетическая модификация

На свет появились генетически модифицированные обезьянки-близнецы, у которых на стадии оплодотворенной яйцеклетки с помощью нового, эффективного и надежного метода CRISPR/Cas9 были изменены сразу два гена.

читать

Ген дурака

Примерно 10000 лет человечество питается генно-модифицированными продуктами. Уже несколько сотен лет такие продукты могут составлять до 100% рациона. Несколько лет назад человечество начало понимать, что именно оно модифицирует в генах.

читать

Революция в синтетической биологии: перспективы и риски

Какие выгоды могут принести исследования в синтетической биологии? Сторонники считают, что эта область биологии преобразит мир подобно революции в области информационных технологий, однако противники настроены скептически.

читать

Новое слово в лечении гипертонической болезни?

Биоинженерное устройство, способное автоматически снижать кровяное давление при выплеске дофамина – «гормона удовольствия» – открывает путь к созданию принципиально новых стратегий лечения гипертонии.

читать