Галлюциногенные дрожжи
D-лизергиновую кислоту теперь можно получать с помощью пекарских дрожжей
Арсений Белосохов, «Элементы»
Рис. 1. Колосок ржи, пораженный спорыньей (Claviceps purpurea). Черные рожки — склероции гриба, образовавшиеся на месте завязи. Они содержат токсины, которые при употреблении в пищу могут вызвать эрготизм. Основной источник заражения — хлеб, испеченный из плохо перебранной муки. В Средние века эпидемии эрготизма случались регулярно. Фото с сайта commons.wikimedia.org
Взаимоотношения людей и лизергиновой кислоты насчитывают много разных эпизодов: она оставила свой след в печальной истории средневековых эпидемий, а сейчас ее производные используются, например, для стимуляции при родах, при лечении паркинсонизма, в психотерапии, а также в рекреационных целях. Однако получение биологически активных стереоизомеров лизергиновой кислоты связано с множеством технических трудностей, из-за чего синтез фармакологически чистых препаратов сопряжен с большими затратами. В недавней работе ученых из Лондона и Сингапура была успешно воспроизведена полная биосинтетическая цепочка, позволяющая получать D-лизергиновую кислоту из культуры пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Результаты этого исследования могут оказать большое влияние на дальнейшую фармакологическую индустрию препаратов, использующих лизергиновые производные.
Лизергиновая кислота и ее производные играют немаловажную роль как в истории, так и в современной медицине. Природный источник этих веществ, относимых к алкалоидам, — гриб спорынья (Claviceps purpurea). Он относится к гипокрейным аскомицетам, паразитирующим за злаках и образующим крупные черные склероции, полные алкалоидов для защиты от поедания. Если такие склероции вместе с неперебранным зерном перемалываются в муку, то выпеченный из нее хлеб будет токсичным: его регулярное употребление в пищу вызывает эрготизм. В средние века эту болезнь называли «антониевым огнем» (гангренозная форма) или «ведьминой корчей» (конвульсивная форма). При гангренозной форме алкалоиды спорыньи стимулируют сужение кровеносных сосудов, из-за чего ткани конечностей могут терять чувствительность и со временем отмирать. При конвульсивной форме поражается нервная система, что приводит к сильным спазмам, судорогам и психозам. Обе формы заболевания могут заканчиваться летальным исходом.
Рис. 2. Основная композиция Изенгеймского алтаря, предстающая перед зрителем, только если открыты и внешние, и внутренние створки. В центральной части находятся вырезанные из дерева скульптуры святых Августина, Антония и Иеронима (слева направо). Под ними — Иисус и 12 апостолов. На боковых створках — эпизоды из жития св. Антония: встреча с Павлом Отшельником (слева) и искушение Антония (справа). В левом нижнем углу правой створки видна фигура человека, больного «антониевым огнем». Алтарь расписан Маттиасом Грюневальдом, резьба по дереву выполнена Николасом Хагенауэром (Nikolaus Hagenauer). Сам алтарь был создан в 1512–1516 годах, до 1793 года он находился в монастыре Св. Антония в Изенгейме. Фото с сайта khanacademy.org
В современном мире алкалоиды спорыньи применяются против мигреней, при лечении болезни Паркинсона (A. Lieberman et al., 1976. Treatment of Parkinson's Disease with Bromocriptine), старческой деменции (B. Winblad et al., 2008. Therapeutic use of nicergoline), артериальной гипертензии (R. M. Tarnowsky, 1954. Clinical Evaluation of Combined Hydrogenated Ergot Alkaloids (Hydergine) in Arterial Hypertension), для стимуляции сокращений матки при естественных родах и для остановки маточных кровотечений при кесаревом сечении (N. Sharma et al,. 2016. Ergot Alkaloids: A Review on Therapeutic Applications). В массовой культуре лизергиновые алкалоиды больше всего известны как естественные предшественники синтетического диэтиламида d-лизергиновой кислоты (ЛСД).
Сейчас получение D-лизергиновой кислоты (D-lysergic acid, DLA) как предшественника для фармакологических препаратов доступно двумя способами: путем экстракции из Claviceps purpurea и путем химического синтеза. Оба способа сопряжены с определенными неудобствами.
Больше половины DLA для фармакологических нужд производится биотехнологическим способом, при котором коммерческие штаммы Claviceps purpurea выращиваются в погруженной культуре в биореакторах. Этот способ дает довольно высокий выход продукта. Проблема, однако, в том, что в «бархатных» условиях стерильного биореактора штаммы гриба имеют свойство быстро «вырождаться» и терять способность производить требуемые вещества, поскольку они нужны грибу для выживания в жестких условиях межвидовой конкуренции и теряют эволюционный смысл при выращивании культуры in vitro.
Более традиционный способ получения DLA подразумевает искусственное заражение злаков и сбор склероциев Claviceps purpurea «в поле». При этом культура сохраняет биохимический потенциал, однако такое производство дороже и дает значительно меньший выход. Также имеется существенный риск, что свойства культуры в ходе естественных эволюционных процессов изменятся, из-за чего сместится спектр производимых ей веществ.
Оба биологических способа получения DLA имеют еще один важный недостаток: Claviceps purpurea производит не одну лишь D-лизергиновую кислоту. На самом деле грибы синтезируют целый ряд алкалоидов: эрготамин, эрготоксин (пептидного типа), эргометрин, эргометринин (алканамидного типа), эргин, эргинин (амидного типа) и метилкарбиноламид α-лизергиновой кислоты. Их содержание сильно варьирует у различных штаммов, а близкое химическое родство делает их сложными для разделения и существенно повышает стоимость экстракции чистой D-лизергиновой кислоты.
В химическом синтезе DLA используются сложные цепочки реакций, включающие от 8 до 19 стадий химических превращений. При этом самая эффективная цепочка из 19 шагов дает выход реакции около 12%, а самая простая (из 8 шагов) — всего 10,6%. В обоих случаях очистка финального продукта от многочисленных примесей, способных вызвать неприятные побочные эффекты, является довольно непростой задачей. Более того, при химическом методе синтеза также не получается достигнуть энантиомерной чистоты. Дело в том что лизергиновая кислота представлена двумя стереоизомерами, которые равновероятно получаются в ходе химического синтеза, однако D-изомер имеет значительно больший высокий потенциал биологической активности, в то время как L-изомер практически не имеет фармакологической ценности. Эти изомеры крайне нелегко разделить при очистке. Из-за этих проблем химическим методом не удается удовлетворить спрос на DLA в фармакологической промышленности (около 20 тонн в год).
Таким образом, имеющиеся на сегодняшний день способы промышленного получения D-лизергиновой кислоты довольно сложны и не обеспечивают того желаемого уровня технологического контроля за получаемым продуктом, который требуется для производства фармакологических препаратов. Ученые из Лондона и Сингапура предлагают альтернативное решение этой задачи. Они попытались «пересадить» генетический аппарат, обеспечивающий путь биосинтеза D-лизергиновой кислоты, спорыньи в хорошо изученный модельный организм, который легко контролировать в ходе биосинтетического производства. В качестве этого организма они использовали обычные пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae.
Изолирование генетического аппарата, обеспечивающего ферментный путь биосинтеза D-лизергиновой кислоты, и помещение его в клетки дрожжей позволяет решить целый ряд проблем. Во-первых, дрожжи с технологической точки зрения — полностью предсказуемый организм, который уже использовался в сотнях (если не тысячах) биотехнологических и биоинженерных исследований У человечества нет другого настолько изученного модельного организма, метаболические пути которого были бы более подробно описаны. Помещение изолированного ферментного каскада внутрь дрожжей исключает потенциальную дегенерацию штамма за счет естественных процессов, а также сильно упрощает коррекцию при возникновении неполадок. Во-вторых, воссоздание ферментного пути в гетерологичной системе (то есть в дрожжах) происходит с помощью селективного пути при отсутствии в системе потенциальных «точек ветвления», способных направить синтез в нежелательном направлении, что теоретически гарантирует отсутствие вариаций в получаемом биосинтетическом профиле. Другими словами, при отсутствии в дрожжах каких-либо ферментов, работающих с похожим субстратом, исключается риск получения спектра похожих субпродуктов, как это происходит в штаммах Claviceps purpurea.
Биосинтез D-лизергиновой кислоты из L-триптофана грибом включает последовательную работу продуктов 8 генов, которые называются DmaW, EasF, EasC, EasE, EasD, EasA, EasG, и CloA. К сожалению, в биоинженерии не всегда возможно просто «скопировать и вставить» — в сложных биологических системах скопированные гены не обязательно работают так же, как в «домашних условиях». Для решения этой проблемы исследователям пришлось искать и подбирать работающие в дрожжах ортологи — ферменты других грибов, гомологичные упомянутым выше ферментам Claviceps purpurea.
Начальный этап биосинтеза (зеленые стрелки на рис. 3) одинаков для всех штаммов всех грибов, производящих эргоалкалоиды. Авторы обсуждаемой работы воспользовались тем, что путь биосинтеза от триптофана (с помощью триптофан-диметилаллилтрансферазы 1, DmaW) до ханоклавин-I-альдегида (с помощью ханокловин-I дегидрогеназы, EasD) был хорошо исследован и описан в предыдущих работах, а необходимые гены, оптимальные для работы внутри клеток дрожжей, имелись в широком разнообразии в базах данных. Ученым потребовалось лишь использовать алгоритм подбора подобия ферментов Enzyme Function Initiative-Enzyme Similarity Tool (EFI-EST) для поиска оптимальных гомологов.
Рис. 3. Путь биосинтеза DLA от триптофана до конечного продукта. Естественные ответвления пути биосинтеза в грибе Claviceps purpurea, ведущие к альтернативным продуктам, показаны бледными цветами. Цветные стрелки указывают этапы пути биосинтеза. Зеленые стрелки: начальный этап синтеза, общий для всех видов. Он состоит из четырех стадий, в которых работают пять ферментов (DmaW, EasF, EasC, EasE и EasD), и ведет к первой крупной точке ветвления — ханоклавин-I-альдегиду. Синие стрелки: завершающий этап, обуславливающий разнообразие алкалоидов у природных штаммов Claviceps purpurea. Этот этап состоит из двух стадий с тремя активными ферментами (EasA, EasG и CloA). Оранжевые стрелки: ответвления пути биосинтеза, ведущие к альтернативным продуктам. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Communications
Так, на стадии превращения из 4-диметилаллил-L-арабина (4DMA) в хоаноклавин-I необходимы продукты генов EasC и EasE. Причем EasE, взятый напрямую из грибов-продуцентов эргоалкалоидов (Claviceps purpurea и биохимически близкие организмы), не работает в клетках дрожжей. На замену оригинальному EasE был взят ближайший работающий аналог — ген easE_Aj гриба Aspergillus japonicus.
С финальными стадиями синтеза задача предстояла намного более сложная — ферменты, напрямую взятые из Claviceps purpurea, не только могут плохо работать в клетках дрожжей, но и несут риск образования нежелательных альтернативных продуктов. Поэтому с помощью того же алгоритма EFI-EST исследователи подобрали функциональные альтернативы.
Фермент EasA — ключевой в превращении ханоклавин-I-альдегида в алкалоиды — имеет две возможные активности: он может выступать как редуктаза, либо как цис-транс-изомераза и представлен множеством различных изоформ, различия между которыми и обуславливают многообразие альтернативных продуктов лизергинового пути. Для получения D-лизергиновой кислоты необходим ортолог, имеющий именно цис-транс-изомеразную активность. Подбор точной изоформы среди многочисленных аналогов потребовал поиска изофункционального кластера, который был проведен с помощью анализа SSN (sequence similarity network). Поиск нужной формы фермента производился с оглядкой на коэкспрессию у штаммов последующих ферментов в цепочке, ведущей к DLA, — EasD и EasG: свидетельства их экспрессии помогли сузить поиск до штаммов с той изоформой EasA, которая с большей частотой имела необходимую активность. Среди всех изоформ фермента нужной оказалась та, которая имела фенилаланин в 176 положении. Всего было установлено три аналога изоформы, работающие в клетках дрожжей: EasA_Ec (Epichloe coenophialia), EasA_Cp (Claviceps purpurea) и EasA_Nl (Neotyphodium lolii). Самая высокая экспрессия в дрожжах наблюдалась при использовании формы EasA_Ec. Ее и стали использовать далее.
Последний этап на пути синтеза D-лизергиновой кислоты включает превращение агроклавина в DLA в процессе окисления. Окисление происходит в два этапа с помощью цитохрома P450 и клавиновой оксидазы (CloA). Одиночное окисление агроклавина приводит к образованию либо элимоклавина, либо лизергола, а двойное — к образованию либо паспаловой кислоты, либо искомой D-лизергиновой кислоты с возможной изомеризацией одной кислоты в другую. Среди всего разнообразия ортологов CloA было обнаружено 15 ответственных за двойное окисление, пять из которых могли работать в клетках дрожжей. Из этих пяти для финальной «сборки» генетического «трасплантата» был выбран ортолог из гриба Claviceps purpurea, поскольку он давал более постоянный титр продукта реакции.
Сборка всех ферментов в одну цепочку потребовала поэтапной оценки успешности работы ферментов. Для этого исследователи взяли несколько линий дрожжей. В первую была произведена вставка начальной цепочки от L-триптофана до 4DMA. После того, как ученые убедились в том, что она хорошо работает, они стали добавлять в каждую последующую линию дрожжей по одному новому гену, проверяя стабильность работы цепочки ферментов на каждом этапе. Наконец, все подобранные гены были успешно собраны и вставлены в геном финального штамма.
Конечная линия дрожжей (штамм DLAM33B) синтезировала чистую D-лизергиновую кислоту в количестве 1,7 мг на литр. С точки зрения использования в производстве этот результат можно назвать вполне посредственным. Однако исследователи надеются, что при тщательном подборе оптимальных биотехнологических параметров культивирования можно будет существенно повысить продуктивность. Основная же ценность проделанной работы заключается в том, что собранная de novo ферментативная цепочка дает биохимически и стехеометрически чистую D-лизергиновую кислоту с полным контролем продукта. Это существенно облегчает тестирование качества и постоянства свойств фармакологических препаратов, которые будут производиться с использованием DLAM33B.
Представленную в обсуждаемой работе технологию вполне можно считать выдающейся. Обычно исследователи стремятся подобрать наиболее подходящий для данной задачи организм, а затем оптимизируют его. Это на порядки проще, чем воссоздание цепочки реакций в новом организме. Перенос генов тоже используется, но чаще всего речь идет о том, чтобы «пересадить» всего один или два гена. При этом, как правило, необходимым конечным продуктом является белок — продукт перенесенного гена (как, например, в случае всем известного флуоресцентного белка GDP). Однако успешный перенос довольно длинной цепочки генов — причем именно чтобы воссоздать ферментативный путь биосинтеза, в ходе которого целевая молекула постепенно превращается в нужную, которая к тому же обладает стереоизомерами, а сама реакция имеет несколько альтернативных продуктов, — является в высшей степени незаурядным результатом и, несомненно, важным шагом для биотехнологии. Вместе с тем пока что такое решение биотехнологических задач является затратным и вряд ли подходит для рядовых проблем. Но оно может оказаться незаменимым для задач, связанных со сложными цепочками превращений с множеством альтернативных продуктов.
Источник: Wong et al., Reconstituting the complete biosynthesis of D-lysergic acid in yeast // Nature Communications. 2022.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru