Как работает «редактор оснований»

«Редактор оснований» на основе CRISPR/Cas9 предотвратил анемию у человеческих эмбрионов

Дарья Спасская, N+1

Китайским исследователям удалось успешно исправить мутацию в гене бета-глобина человеческих эмбрионов, приводящую к развитию анемии. В качестве инструмента для редактирования генома ученые применили «редактор оснований», разработанный на основе системы CRISPR/Cas9. С его помощью удалось направленно внести в геном однонуклеотидную замену в четверти случаев. Исследование было опубликовано в журнале Protein & Cell, также о нем рассказывается в редакционной статье журнала Nature.

Мутации в генах, кодирующих цепи гемоглобина, являются причиной развития талассемии – анемии, вызванной нарушением синтеза гемоглобина. Однонуклеотидная замена аденина на гуанин в регуляторной области гена HBB (HBB −28 A>G), кодирующего бета-глобин, входит в тройку самых распространенных причин бета-талассемии в Китае и Юго-Восточной Азии. Эта мутация приводит к снижению экспрессии гена HBB и, как следствие, к гемоглобиновой недостаточности у ее носителя.

Китайским исследователям из университета Сунь Ятсена удалось исправить эту мутацию в человеческих эмбрионах, превратив G обратно в A при помощи нового инструмента редактирования генома на базе CRISPR/Cas9. Эффективность редактирования составила 40 процентов на уровне эмбрионов и 23 процента на уровне отдельных клеток.

В новой системе, получившей название «редактор оснований» (base editor) (с публикацией, посвященной разработке этого метода, можно ознакомиться здесь), используется каталитически неактивный белок dCas9, неспособный разрезать ДНК. Такой белок в комплексе с направляющей РНК служит средством доставки пришитого к нему «рабочего» домена к определенной последовательности в ДНК.

Рабочей частью в «редакторе» служит фермент цитозиндеаминаза, которая «отрывает» аминогруппу от цитозина, оставляя на его месте урацил. В результате в ДНК образуется «неправильная» пара U:G (урацил напротив гуанина), которая распознается системой репарации неспаренных оснований. Дополнительная модификация метода позволила добиться того, что в цепи репарируется именно G. Это приводит к образованию «правильной» пары U:A, которая после раунда репликации превращается в T:A. Схема метода представлена ниже, а освежить в памяти принцип работы системы CRISPR/Cas9 можно здесь.

Принцип работы «редактора оснований». Голубым цветом отмечен неактивный Cas9 (dCas9), красным – цитозиндеаминаза, зеленым – направляющая РНК. После связывания гибридного белка с нужным участком ДНК, цитозиндеаминаза превращает цитозин в урацил, в результате чего, после репарации и раунда репликации, пара G:C заменяется на A:T

Немногим ранее другая исследовательская группа продемонстрировала, что этот метод применим в трипронуклеарных зиготах («бракованных» эмбрионах, полученных путем искусственного оплодотворения, содержащих тройной набор хромосом). В новой работе исследователям требовались эмбрионы, содержащие мутацию HBB −28 (A>G) в двух копиях. Такие эмбрионы были получены путем клонирования – слияния соматической клетки пациента с талассемией с безъядерной яйцеклеткой.

Вскоре после слияния исследователи вводили в полученные одноклеточные эмбрионы мРНК «редактора» и направляющую РНК для него. Через 48 часов, после того, как развивающиеся эмбрионы успевали пройти три-четыре деления, авторы анализировали, прошло ли редактирование. Анализ проводился путем секвенирования участка с мутацией, которую нужно было исправить, и десяти дополнительных сайтов, куда потенциально мог бы привлечься «редактор».

В первом эксперименте анализ суммарной ДНК 22 эмбрионов показал, что в 9 случаях редактирование прошло правильно, и G заменилась на A. Еще в одном G заменилась на С. Таким образом, успешное редактирование прошло в 40 процентах эмбрионов.

Во втором эксперименте эффективность редактирования оценивали на уровне отдельных клеток эмбрионов. В этом случае доля успеха составила 11 из 48, при этом в восьми случаях редактирование прошло по обеим цепям, то есть исправились обе копии гена HBB. Однако такое несовпадение результата на уровне отдельных клеток и на уровне эмбрионов напрямую указывает на то, что все исследуемые эмбрионы получились "мозаиками". Это означает, что после редактирования в разных клетках одного и того же эмбриона генотип отличается. Мозаичность эмбрионов на сегодняшний день - одна из основных и нерешенных проблем редактирования людей.

Та же исследовательская группа два года назад опубликовала пионерскую работу, посвященную редактированию генома человеческих эмбрионов, о чем можно прочитать здесь. В прошлой работе ученые пытались исправить мутацию в гене HBB при помощи «канонической» системы CRISPR/Cas9 с использованием гомологичной рекомбинации для внесения замены в ДНК. Однако эффективность редактирования оказалась очень низкой – оно прошло только в четырех случаях для 54 исследованных эмбрионов.

Множество исследований на клетках человека с тех пор подтвердили, что при помощи Cas9 ген легко «сломать», но очень сложно «починить». Использование неактивного Cas9 как средства доставки других белков значительно расширило возможности этой системы.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru