Шаг к моделированию мира РНК

Рибозим справился с синтезом своего предка

Вера Мухина, N+1

При помощи направленной эволюции ученые вывели рибозим, который способен синтезировать своего предка, – более короткую молекулу РНК, также обладающую каталитической активностью. Эта работа, опубликованная в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences (Tjhung et al., An RNA polymerase ribozyme that synthesizes its own ancestor), приближает воссоздание самореплицирующихся РНК-систем, которые – если верить гипотезе РНК-мира – дали начало всей жизни на Земле.

Весомым подтверждением гипотезы РНК-мира, постулирующей возникновение жизни из самовоспроизводящихся РНК-форм, можно было бы считать получение таких систем in vitro. За последние годы в этом направлении было сделано очень много, но вырастить при помощи направленной эволюции полностью самовоспроизводящуюся систему пока не получается. Для этого рибозим, синтезирующий РНК – РНК-полимераза – должен уметь аккуратно синтезировать как свою собственную последовательность, так и комплементарную для использования ее в качестве матрицы. Некоторые выращенные in vitro рибозимы уже умеют копировать себя частично или даже полностью, но эти реакции зависят от подборки субстратов-олигонуклеотидов, ограничивающих способность синтезируемой РНК к мутациям и эволюции.

Катрине Джунг и ее коллегам из Института Солка удалось вырастить РНК-полимеразу, которая способна синтезировать из мононуклеотидов хоть и не саму себя, но предковый рибозим. За основу была взята уже известная полимераза 24-3. Ее получили раньше из других рибозимов и она уже умела копировать небольшие последовательности РНК. Исследователи задались целью эволюционировать этот фермент так, чтобы она могла синтезировать сложные рибозимы, и в качестве промежуточной цели решили добиться синтеза рибозима-эндонуклеазы, способной разрезать РНК.

Для «обучения» полимеразы они использовали метод направленной эволюции. Слегка мутировавшие последовательности исходной полимеразы прикрепляли к поверхности при помощи праймера, а затем давали ей поработать. Если она справлялась с работой и синтезировала нормальную эндонуклеазу, та отрезала ее от поверхности, а если нет, то полимераза так и оставалась прикрепленной. Попавшие в раствор полимеразы исследователи размножали с добавлением новых мутаций и затем повторяли с ними цикл, но давая уже меньше времени на работу. Таким образом, на новый уровень отбирали только функциональные полимеразы, и с каждым циклом они все шустрее справлялись с заданной задачей. Всего ученые провели 38 циклов, но более-менее эффективные полимеразы появились уже на 14 раунде. В ходе эволюции исследователи получили три семейства рибозимов, из которых полимераза 38-6 оказалась наиболее эффективной. От исходной последовательности полимеразы 24-3 ее отличали 14 мутаций.

Схема работы готовой полимеразы. На первом этапе к ней пришивают праймер, прикрепленный к поверхности. Далее его последовательность достраивается по РНК образцу. Свежесинтезированная последовательность сворачивается в молоточкоподобную структуру, обладающую собственной ферментативной последовательностью и откусывает полимеразу. Рисунок из статьи в PNAS.

Удостоверившись в работоспособности полимеразы, авторы статьи задали ей задачу синтезировать другой рибозим, – лигазу I класса. Он был выбран не случайно. По сути, эта лигаза – простой предок самой полимеразы. У них общее каталитическое ядро, 77 процентов последовательности которого у них одинаковые.

Несмотря на успех с эндонуклеазой, в этом случае у рибозима 38-6 возникли проблемы с точностью. Лигаза состоит примерно из ста рибонуклеотидов, и для ее безошибочного синтеза требуется аккуратность не менее 99 процентов. Но полимеразе 38-6 лишь в 83 процентах случаев удавалось подставить правильный рибонуклеотид. Этого явно недостаточно для полноценного синтеза лигазы и тем более для синтеза самой полимеразы, длина которой в два раза больше.

Чтобы упростить задачу, исследователи разобрали лигазу на три отдельные последовательности, способные собираться в единую рабочую структуру. Такой комплекс слегка уступает в эффективности обычной лигазе, но синтезировать его без ошибок гораздо проще.

РНК-лигаза, каждая из трех цепей которой была синтезирована рибозимом-полимеразой.

Параллельный синтез трех цепочек оказался успешным, и, по словам ученых, это самый длинный и сложный рибозим, синтезированный из отдельных мононуклеотидов. Авторы статьи предполагают, что дальнейшие улучшения системы могут подтянуть точность рибозима до уровня, на котором будет возможна его нормальная саморепликация.

В задачи этого исследования входило создание самореплицирующегося рибозима, тогда как сборка кирпичиков для его постойки – нуклеозидов – осталась за его пределами. Между тем, они абсолютно необходимы для синтеза и до сих пор не до конца понятно, откуда доисторические рибозимы их брали. Уже предложено несколько способов синтеза каждого нуклеозида, но они оказались несовместимы друг с другом. В недавнем исследовании ученые предположили, что разгадка кроется в циклической смене влажности, благодаря которой чередовались подходящие условия для синтеза разных нуклеозидов.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru