Тихая гавань
Эффективность, длительность действия и управляемость многих перспективных методов генной и клеточной терапии онкологических, генетических и других заболеваний могут быть улучшены в благодаря так называемым «безопасных геномных портов» (genomic safe harbor, GSH). Это участки в геноме человека, в которые можно безопасно встраивать терапевтические гены, не вызывая нежелательных изменений в геноме клетки, которые могут представлять опасность для пациента.
Однако найти GSH с потенциалом для клинического применения сложно, так как они должны одновременно обладать доступностью для технологий редактирования генома, не иметь механических препятствий в виде генов и других функциональных последовательностей нуклеотидов и обеспечивать высокую, стабильную и безопасную экспрессию внедренного терапевтического гена.
До сих пор было изучено лишь несколько кандидатов в GSH, и все они могли использоваться с определенными оговорками. Они либо расположены в геномных областях, которые относительно плотно заполнены генами, которые могут пострадать в процессе редактирования, либо содержат гены, играющие роль в развитии онкологических заболеваний, которые могут быть случайно активированы. Кроме того, известные до сих пор GSH не были оценены на наличие элементов, которые, хотя и не являются генами, но могут регулировать их экспрессию, а также на то, могут ли вставленные гены изменить паттерны экспрессии всего генома.
Группа исследователей из Гарвардского института Висса, Гарвардской медицинской школы и Высшей технической школы Цюриха разработала вычислительный метод для идентификации GSH с более высоким потенциалом для безопасной вставки терапевтических генов и их долговременной экспрессии во многих типах клеток. Два из 2000 таких участков GSH исследователи протестировали для Т-клеточной терапии и генной терапии заболеваний кожи ex vivo. Они вставили в идентифицированные GSH репортерный ген в Т-клетках и терапевтический ген в клетках кожи и продемонстрировали безопасную и длительную экспрессию этих генов.
Анализ генома на наличие GSH
Исследователи сначала создали вычислительный алгоритм, который позволил им отыскать в геноме участки, потенциально пригодные для использования в качестве GSH. В этом пошаговом сканировании всего генома они исключили гены, кодирующие белки, которые были вовлечены в образование опухолей, и гены, кодирующие определенные типы РНК, которые влияют на экспрессию. Также были исключены области, содержащие энхансеры – элементы, которые активируют экспрессию генов, и области, которые включают центры и концы хромосом, чтобы избежать ошибок в репликации и сегрегации хромосом во время деления клеток. После такого отбора осталось около 2000 локусов-кандидатов, которые должны быть дополнительно исследованы в клинических и биотехнологических целях.
Из 2000 идентифицированных потенциальных «тихих гаваней», в которые могут быть безопасно вставлены гены, группа случайным образом выбрала пять GSH и исследовала их на клеточных линиях, вставив гены в каждый из них, используя быструю и эффективную стратегию редактирования генома на основе CRISPR-Cas9. Два GSH показали наиболее высокий результат: вставленные в них гены демонстрировали активную экспрессию, значительно бОльшую, чем экспрессия, достигнутая при вставке генов в два ранее выявленных GSH.
Для дальнейшего изучения двух наиболее привлекательных участков GSH группа исследовала их в Т-клетках и клетках кожи. Т-клетки используются при клеточной терапии для лечения рака и аутоиммунных заболеваний. Если ген, кодирующий химерный антигенный рецептор (CAR), мог быть аккуратно вставлен в GSH, клеточная терапия стала бы более безопасной. Кроме того, заболевания кожи, вызванные патогенными мутациями в генах, контролирующих функцию клеток в различных слоях кожи, потенциально могут быть излечены путем введения и долгосрочной экспрессии здоровой копии мутантного гена в GSH быстро делящихся клеток кожи.
Исследователи ввели флюоресцентный репортерный ген в два новых GSH в Т-клетках человека, полученных из крови, и полностью функциональный ген LAMB3, кодирующий субъединицу ламинина (белка внеклеточного матрикса, образующего базальные мембраны), в фибробластах кожи человека. Группе удалось добиться стойкой экспрессии вставленных генов в родительских и дочерних клетках.
Секвенирование генома Т-клеток, сконструированных на основе GSH, показало, что редактирование несет минимальный риск эффектов, способствующих развитию опухоли, что всегда является основной проблемой при генетической модификации клеток для терапевтического использования. Идентификация GSH в геноме человека значительно ускорит развитие более эффективных и безопасных методов генной и клеточной терапии. Успех, достигнутый на клетках кожи, может быть использован для ее омоложения с помощью генотерапии.
Статья E.Aznauryan et al. Discovery and validation of human genomic safe harbor sites for gene and cell therapies опубликована в Cell Reports Methods. https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(21)00231-9
Аминат Аджиева, портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard: Landing therapeutic genes safely in the human genome.