Эмбриональные стволовые клетки – лекарство от старости (2)

(Продолжение. Начало статьи – здесь.)

II. ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ:
ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ, ПОДДЕРЖАНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ И ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) являются плюрипотентными стволовыми клетками, получаемыми на разных стадиях эмбрионального развития. чЭСК обладают уникальной способностью к неограниченной пролиферации и дифференцировке в клетки всех типов тканей. Неограниченный потенциал чЭСК обуславливает их особенную привлекательность для использования в клинической практике. В частности, способность чЭСК к регенерации может быть ключом к успеху лечения возрастных болезней, характеристикой которых, как обсуждалось в предыдущем разделе, является прогрессирующее нарушение функционирования и/или гибель соматических клеток.

Таблица 1.
Методы дифференцировки чЭСК в определенные типы клеток
для использования в терапии возрастных болезней

A. Источники и выделение чЭСК

Обычно чЭСК выделяют методом микрохирургического удаления внутренней клеточной массы (ВКМ) из доимплантационного эмбриона на стадии бластоцисты (рис. 1). Составляющие ВКМ клетки являются плюрипотентными, то есть они обладают способностью дифференцироваться в экстраэмбриональную эндодерму и три зародышевых слоя, формирующих все ткани эмбриона: эктодерму, мезодерму и эндодерму. В определенных условиях эти клетки могут пролиферировать in vitro, сохраняя недифференцированное состояние и плюрипотентность в течение неопределенно долгого времени. С целью создания клеточных линий чЭСК также выделяли из единичных бластомер 4- или 8-клеточных эмбрионов [5-8], 16-клеточной морулы [9, 10] и ВКМ партеногенетических эмбрионов. Единичная бластомера обладает высокой степенью тотипотентности и способна давать начало целому эмбриону. Поэтому чЭСК, полученные из бластомер, позволяют обойти этически противоречия, связанные с использованием чЭСК, так как теоретически удаление единичной бластомеры не должно лишить оставшиеся бластомеры способности к формированию нормального эмбриона. Аналогичным образом, партеногенетические эмбрионы, формирующиеся в результате искусственного оплодотворения донорских яйцеклеток [11-14], являются приемлемыми источниками чЭСК, так как в данном случае исключается необходимость создания и последующего разрушения жизнеспособных эмбрионов. Более того, выделенные из партенотов чЭСК являются особенно привлекательным материалом, так как они гомозиготны по аллелям антигенов человеческого лимфоцитарного антигена (HLA), что может предотвратить развитие реакции иммунологического отторжения при использовании чЭСК для трансплантации (обсуждается далее). Со времени первого выделения плюрипотентных чЭСК из ВКМ, проделанного в 1998 году Томсоном и коллегами [15], из клеток, выделенных из различных эмбриональных источников, были созданы сотни линий чЭСК, в настоящее время используемые во всем мире для проведения фундаментальных и клинических исследований. В США используется более 80 линий чЭСК, соответствующих государственным требованиям [16], некоторые из них в настоящее время применяются в рамках клинических исследований.

B. Клеточные и молекулярные характеристики плюрипотентных чЭСК

Плюрипотентные чЭСК обладают специфическими морфологическими и молекулярными свойствами, характерными для большинства линий чЭСК. К морфологическим параметрам одиночной чЭСК относятся увеличенное ядро и различимые ядрышки. В культуре пролиферирующие чЭСК формируют компактные колонии, состоящие из клеток округлой формы (рис. 2). В процессе дифференцировки эти колонии утрачивают свою компактную морфологию, при этом на границах колонии появляются распластанные клетки – мигрирующие из колонии дифференцированные клетки. Спонтанную дифференцировку чЭСК в культуре можно предотвращать путем регулярного добавления свежей питательной среды [17].

Рисунок 2. Типичные недифференцированные и дифференцированные чЭСК в культуре.
(A) Компактную колонию пролиферирующих плюрипотентных чЭСК можно наблюдать при культивировании в соответствующей среде на фидерном слое из мышиных эмбриональных фибробластов.
(B) Плавающие в среде человеческие эмбриоидные тельца (чЭТ) появляются через 3 дня после индукции дифференцировки.
(C) Дифференцирующиеся клетки, в том числе кардиомиоциты, появляются внутри адгезионных культур через 48 часов после посева чЭТ в покрытый желатином культуральный планшет. Одно деление шкалы = 25 мкм.

В результате работы международной инициативы по изучению стволовых клеток (International Stem Cell Initiative) – консорциума, в котором приняли участие исследователи более чем из 15 стран, – была создана панель маркеров, идентифицированных для 59 полученных независимо друг от друга линий плюрипотентных чЭСК [18]. Данные маркеры нашли применение в рутинной оценке характеристик плюрипотентных чЭСК. К ним относятся гены, известные функции которых заключаются в поддержании плюрипотентности или других процессах развития, такие как Nanog, POU-домен класса 5 гомеодомен-1-содержащий белок (POU5F/OCT4), тератокарциономоподобный фактор роста-1 (TDGF1), ДНК(цитозин-5)-метилтрансфераза-3-бета (DNMT3β), А-рецептор-бета-3 гамма-аминомасляной кислоты (GABRB3) и фактор роста и дифференцировки-3 (GDF4). Плюрипотентные чЭСК также экспрессируют ряд поверхностных маркеров, таких как стадиеспецифические эмбриональные антигены-3 и -4 (SSEA-3, SSEA-4), а также кератиносульфатные (TRA-1-60, TRA-1-81, GDTM2 и GCT343) и белковые антигены (CD9 и Thy1). Более того, чЭСК можно также идентифицировать на основании экспрессии щелочной фосфатазы, фактора стволовых клеток (SCF/c-Kit лиганд) и белков HLA I класса. В настоящее время ведется работа по составлению профиля экспрессии микроРНК в плюрипотентных чЭСК. Несмотря на то, что до сих пор не проведено обстоятельного исследования экспрессии миРНК, при проведении нескольких работ был идентифицирован ряд кластеров микроРНК, выраженная экспрессия которых характерна для линий чЭСК. Некоторые из них известны благодаря участию в поддержании плюрипотентного состояния чЭСК [19, 20]. К ним относятся микроРНК-92b, кластер миРНК-302, миРНК-200c, кластеры миРНК-368 и миРНК-154*, миРНК-371, миРНК-372, миРНК-373*, миРНК-373 и кластер миРНК-515 [21, 22]. Плюрипотентные чЭСК также обладают отличительными эпигенетическими характеристиками. В целом, структура хроматина чЭСК представляет собой открытую конформацию, позволяющую факторам транскрипции проникать внутрь нее и регулировать уровни экспрессии генов [23]. Кроме того, профили метилирования ДНК чЭСК отличаются от профилей метилирования клеток других типов. Отличительным признаком являются сниженные уровни метилирования динуклеотидов CpG, особенно характерные для промотерных регионов генов, ответственных за плюрипотентность, таких как OCT4 и Nanog [24]. Эти уникальные эпигенетические признаки чЭСК необходимы для поддержания статуса их плюрипотентности и, соответственно, пригодны для использования в качестве маркеров недифференцированных чЭСК.

C. Определение плюрипотентности чЭСК

чЭСК способны к дифференцировке в клетки, формирующие три зародышевых листка. Этот факт можно проверить с использованием общепринятых in vivo и in vitro методик, обычно используемых для подтверждения плюрипотентности линий чЭСК. Наиболее часто применяемый in vivo метод подразумевает индукцию формирования тератомы после трансплантации недифференцированных чЭСК иммунодефицитным мышам [25-28]. Тератомы представляют собой доброкачественные опухоли, состоящие из тканевых структур, сформировавшихся из всех трех эмбриональных зародышевых листков (рис. 3).

Рисунок 3. Формирование тератомы является методом оценки способности чЭСК к дифференцировке в условиях in vivo.
Пролиферирующие культуры чЭСК использовали для формирования тератом путем их имплантации в почечную капсулу с помощью традиционных методов [25-28].
(А) Эксплантированная тератома.
(B-F) Для идентификации эмбриональных тканей срезы тератом окрашивают гематоксилином и эозином. На фотографии видны характерные ткани, относящиеся ко всем трем эмбриональным листкам, в том числе мезодерме (B,C), эндодерме (D) и эктодерме (E,F).
(B) Зарождающиеся почечные канальцы и клубочки, погруженные в примитивный почечный эпителий.
(C) Хрящ, окруженный капсулой из уплотненной мезенхимы.
(D) Железистая кишечная структура.
(E) Зарождающаяся нервная трубка.
(F) Примитивный плоский эпителий.
Деление шкалы на микроснимках – 100 мкм.

Результаты анализа тератом, сформировавшихся из прижившихся чЭСК, можно использовать для определения их способности к дифференцировке. Способность чЭСК дифференцироваться в клетки различных типов также можно протестировать in vitro путем формирования эмбриоидных телец (ЭТ). ЭТ представляют собой сферические колонии неадгезированных дифференцирующихся чЭСК, содержащие популяции клеток, характерных для всех трех эмбриональных зародышевых листков. В подходящих условиях ЭТ могут дифференцироваться в клетки определенных типов. Как будет описано ниже, формирование ЭТ обычно используется в качестве промежуточного этапа при направленной дифференцировке чЭСК в тканеспецифичные популяции клеток.

Таблица 2. Стандартизация и контроль качества чЭСК для использования в клинической практике

Продолжение: дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток в клетки определенных типов.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru

19.12.2011