Репрограммирование клеток для регенеративной медицины (2)
Моделирование заболеваний in vitro
(Продолжение, начало статьи – здесь.)
Исследователи уже начали работу над созданием экспериментальных моделей путем репрограммирования клеток пациентов с широким спектром заболеваний, в том числе с муковисцидозом, болезнью Гентингтона, болезнью Паркинсона, серповидноклеточной анемией, врожденным дискератозом, семейным боковым амиотрофическим склерозом. Этот список быстро увеличивается (Grskovic et al., 2011; Park et al., 2008b; Dimos et al., 2008; Mali et al., 2008; Somers et al., 2010; Ghodsizadeh et al., 2010; Agarwal et al., 2010). Работа с такими моделями позволит изучить не только механизмы развития заболеваний, но и взаимосвязь между генотипом и фенотипом.
Например, изучение наследственного синдрома удлиненного интервала QT in vitro было затруднено невозможностью получения человеческих кардиомиоцитов, несущих причинную мутацию (Behr et al., 2008). В рамках недавней работы ученые получили иПСК пациентов с моногенным синдромом удлиненного интервала QT I типа, дифференцировали их в кардиомиоциты и проанализировали характерные для них электрофизиологические параметры (Moretti et al., 2010). По сравнению с клетками здоровых людей, клетки пациентов продемонстрировали более продолжительный потенциал действия и аномальную локализацию белков. На основании этих данных авторы определили механизм развития заболевания как доминантно-негативный. В статье, опубликованной немного позже, исследователи описывают результаты изучения другого варианта наследственного синдрома удлиненного интервала QT, причиной которого является мутация в другом гене (Itzhaki et al., 2011). Авторы идентифицировалиы дополнительные ассоциированные с заболеванием электрофизиологические особенности клеток пациентов. Кроме того, авторы провели небольшой скрининг, целью которого была оценка способности химических соединений облегчать проявления заболевания. Существование двух таких моделей позволяет непосредственно сравнивать клеточные фенотипы, обусловленные разными генотипами, при одном и том же заболевании, а также, возможно, позволит повысить эффективность его лечения (рисунок 2).
Рисунок 2. Возможности, предоставляемые моделями заболеваний, созданными путем репрограммирования клеток.
Результаты десятков подобных исследований уже опубликованы и обобщены в недавних обзорных статьях (Grskovic et al., 2011; Tiscornia et al., 2011; Unternaehrer and Daley, 2011). Однако не стоит забывать, что методы использования иПСК для моделирования заболеваний все еще находятся в зачаточном состоянии и работающие в этой области исследователи сталкиваются с серьезными сложностями. Ниже перечислены вопросы, которые должны решать специалисты, работающие над моделями любых заболеваний.
Протоколы непосредственной дифференцировки и культивирования клеток
Работа над методами превращения плюрипотентных клеток в клетки определенного типа ведется уже много лет. Некоторые полностью функциональные высокоспециализированные клетки, в том числе двигательные нейроны и кардиомиоциты, уже получены с помощью протоколов, повторяющих механизмы, задействованные в процессе развития эмбриона. Однако для других «долгожданных» клеток, таких как бета-клетки поджелудочной железы и гемопоэтические клетки, получены в лучшем случае лишь подобия, фенотип которых значительно отличается от оригинала (Kroon et al., 2008; Zhang et al., 2009). Основной причиной этого является недостаток информации об условиях, направляющих дифференцировку этих клеток во время развития эмбриона.
Определение подлинности «клеток-мишеней»
Тканевая принадлежность клеток определяется их фенотипом, состоящим из множества компонентов. Для работы с клетками того или иного типа, полученными из иПСК, специалисты должны сначала убедиться в том, что продукт, выращенный in vitro, идентичен своему прототипу in vivo. Эту оценку идентичности необходимо проводить на разных уровнях, она должна включать анализ генной экспрессии, состояния хроматина и функциональности. Активность транскрипции и уровень метилирования оцениваются одинаково для всех типов клеток, тогда как специфичные маркеры типовой принадлежности, а также методы анализа тканеспецифичных функций должны подбираться индивидуально для каждого типа клеток-мишеней.
Идентификация адекватных болезнеспецифичных клеточных фенотипов
В некоторых случаях клетки, полученные из иПСК пациентов с различными заболеваниями, демонстрируют четкие предсказуемые фенотипы, такие как описанные выше электрофизиологические отклонения у кардиомиоцитов. При других заболеваниях результат анализа на фенотип болезни может быть неоднозначным или может указывать на отсутствие статистически значимого отличия между линиями болезнеспецифичных и нормальных клеток. Например, в недавно опубликованной статье описано сравнение линий иПСК, выделенных у больных с идиопатической болезнью Паркинсона и здоровых людей группы контроля (Soldner et al., 2009; Hargus et al., 2010). Авторы планировали сопоставить способность иПСК здоровых людей и пациентов формировать допаминергические нейроны при применении протокола прямой дифференцировки, а также функционирование таких нейронов при их трансплантации в различные животные модели болезни Паркинсона. На практике отличие между болезнеспецифичными и нормальными нейронами удалось выявить только на мышиной модели в одном из трех поведенческих тестов.
Подобные случаи должны напоминать исследователям об их ответственности за подтверждение соответствия созданных ими «болезнеспецифичных фенотипов» биологическим особенностям рассматриваемой болезни.
Выявление заболеваний, для которых подходит работа с моделями на основе иПСК
Пример с идиопатической (вызванной неустановленной причиной) болезнью Паркинсона является предостережением о том, что моделирование заболеваний с помощью иПСК в одних случаях более информативно, чем в других. Возможно, репрограммирование является еще слишком малоапробированным инструментом для того, чтобы прогнозировать, моделирование каких заболеваний эффективно, а каких – нет. Однако в будущем этот вопрос должен решиться.
Определение заболеваний, наиболее подходящих для работы с моделями, созданными из эмбриональных стволовых клеток
Болезнеспецифичные линии эмбриональных стволовых клеток, полученные при проведении преимплантационной генетической диагностики, подходят для изучения определенных состояний лучше, чем линии иПСК. Одним из примеров является синдром ломкой Х-хромосомы, для которого характерно аномальное подавление активности гена FMR1 в процессе развития. Из-за невозможности реактивировать мутантный локус в процессе репрограмирования (Urbach et al., 2010) болезнеспецифичные иПСК не экспрессируют ген FMR1. Эти клетки могут дифференцироваться в нейроны с инактивированным геном FMR1 (Sheridan et al., 2011), однако они не позволяют изучать механизмы, обеспечивающие патологическое подавление активности гена.
Репрограммирование не идеально «перезагружает» эпигеном клеток
Сравнению эпигенетического статуса иПСК и эмбриональных стволовых клеток было посвящено несколько исследований. По глобальному профилю метилирования иПСК гораздо ближе к эмбриональным клеткам, чем к клеткам тканей своего происхождения (Doi et al., 2009; Lister et al., 2011), однако эпигеномы иПСК и ЭСК не полностью идентичны.
Было установлено, что определенные классы эпигенетических маркеров избегают происходящего при репрограммировании «обнуления данных». При попытках дифференцировать выделенные из разных тканей иПСК в клетки различных типов было замечено, что репрограммированные клетки легче дифференцируются в клетки тканей, принадлежащих тому же типу, к которому принадлежали исходные клетки. В некоторых случаях иПСК даже сохраняют остаточное метилирование, отражающее их исходную тканевую принадлежность. Эти данные свидетельствуют о наличии у иПСК эпигенетической памяти, суть которой заключается в том, что при репрограммировании небольшое количество эпигенетических меток не устраняется, что происходит, по-видимому, случайным образом (Kim et al., 2010, 2011). Однако исследователи также заметили, что при длительном культивировании профиль метилирования иПСК постепенно приближается к профилю метилирования ЭСК (Nishino et al., 2011). Другие ученые показали, что определенные регионы хромосом, располагающиеся в непосредственной близости от теломер и центромер, могут быть особенно устойчивы к удалению эпигенетических меток при репрограммировании и что особенности метилирования ДНК этих регионов могут сохраняться даже при дифференцировке (Lister et al., 2011).
Причины эпигенетической вариабельности in vivo: окружающая среда и стохастичность
Специалистам давно известно, что даже преходящие воздействия факторов окружающей среды часто приводят к появлению в эпигеноме изменений, оказывающих продолжительное влияние на поведение клеток за счет изменения транскрипционной активности (Bell and Spector, 2011; Waterland and Jirtle, 2004; McGowan et al., 2009; Anway et al., 2006).
Стохастические процессы также вносят вклад в вариабельность организации эпигенома. Оценочная точность воспроизведения наследуемого специфичного метилирования у человека составляет 90-98% (Ushijima et al., 2003; Genereux et al., 2005). Однако очевидно, что даже существующая небольшая погрешность с каждым делением клетки вносит изменения в метилом клетки с намного большей скоростью, чем скорость, с которой в принципе способны накапливаться мутации последовательности ДНК. В отличие от прогнозируемых эпигенетических модификаций под действием факторов окружающей среды, этот тип изменений в метилировании ДНК возникает случайным образом.
Одновременно с появлением вызванных воздействием факторов окружающей среды и стохастических изменений в эпигеноме человека медленно накапливаются вариации, являющиеся отражением условий его жизни (Wong et al., 2010). Некоторые люди также могут быть генетически предрасположены к более или менее выраженным периодическим изменениям эпигенома (Bjornsson et al., 2008; Feinberg and Irizarry, 2010). Учитывая тот факт, что определенная часть этих вариаций оказывает влияние на экспрессию генов, индивидуальный эпигеном определяет реакции клеток на определенные воздействия и, соответственно, может обуславливать предрасположенность к болезням или крепкое здоровье.
Окончание: Геномика, эпигеномика и внешние воздействия
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
15.06.2012