Репрограммирование клеток для регенеративной медицины (3)

Геномика, эпигеномика и внешние факторы

(Окончание, начало статьи – здесь.)

Вклад генетики, окружающей среды и эпигенетики в развитие заболеваний с комплексной этиологией

Несмотря на то, что однояйцовые близнецы имеют идентичные геномы, нередки случаи, когда в течение жизни у одного из них развивается заболевание с комплексной этиологией, например, шизофрения, диабет 2 типа или болезнь Паркинсона. Традиционно такая фенотипическая вариабельность рассматривается как сумма генетической вариабельности и вариабельности факторов окружающей среды (Visscher et al., 2008). Однако такая точка зрения смешивает эффекты воздействия факторов окружающей среды в конкретный момент времени и долгосрочных эпигенетических изменений, не учитывая эпигенетические изменения, являющиеся результатом стохастических процессов или генетической предрасположенности к изменчивости эпигенома. Невозможность отличить результаты случайных воздействий со стороны окружающей среды от случайных эпигенетических изменений может быть причиной неспособности идентифицировать и анализировать фенотипы моделей заболеваний in vitro. Поэтому при моделировании заболевания более информативным подходом является допущение, что клеточные фенотипы заболевания формируются под действием трех типов по-разному наследующихся факторов:

• Генетическая предрасположенность. Вариации последовательности ДНК могут увеличивать или снижать вероятность появления определенного клеточного фенотипа. Последовательности ДНК полностью и точно передаются дочерним клеткам во время деления.
• Воздействия окружающей среды (неэпигенетические). Условия внешней среды (дефицит питательных веществ или воздействие химических веществ) в каждый конкретный момент времени оказывают влияние на состояние и функции клеток. Эти условия являются внешними факторами и не передаются дочерним клеткам.
• Эпигенетические эффекты. Эти стабильные и с высокой степенью вероятности передающиеся дочерним клеткам изменения экспрессии генов возникают в результате (1) воздействия факторов внешней среды, (2) стохастических эпигенетических изменений и (3) генетической предрасположенности к таким изменениям.

С учетом этого заболевания человека можно рассматривать как суммарный результат генетических, внешних и эпигенетических факторов (Petronis, 2006). Причиной развития некоторых редких заболеваний является только один из этих эффектов, тогда как многие распространенные болезни вызываются полной триадой причинных факторов. Все это следует учитывать при моделировании заболеваний с помощью иПСК. Ниже описаны примеры редких монофакторных патологий, после чего обсуждаются более распространенные полифакторные заболевания.

Генетические болезни

К монофакторным заболеваниям относятся состояния, при которых единственный ген ответственен за наличие, отсутствие или тяжесть определенного фенотипа. К генным вариантам, вызывающим подобные патологии, относятся CAG-повторы при болезни Гентингтона, мутации в генах факторов свертывания крови при гемофилии и измененные формы ионных каналов при наследственном синдроме удлиненного интервала QT. Существуют также полифакторные болезни, вызываемые комбинацией определенных генетических вариантов, независимо от внешних и эпигенетических эффектов, а также патологии, развивающиеся в результате соматической мутации. Для заболеваний, вызываемых нарушением последовательности ДНК, иПСК, созданные из клеток, имеющих эту мутацию, будут носителями причинного генотипа. При дифференцировке таких клеток получаемые клетки-мишени будут иметь вызывающий заболевание генетический дефект.

Болезни, вызванные воздействием окружающей среды

Такие болезни возникают непосредственно в результате воздействия факторов окружающей среды. Наглядным примером является ожог, вызываемый попаданием кипящей воды на кожу. В подобных ситуациях эпигенетические и генетические факторы и, соответственно, наследуемость исключены. Сравнение иПСК, полученных из клеток пациента и здорового человека, не предоставит никакой информации о патофизиологии ожога.

Эпигенетические болезни

К эпигенетическим относятся заболевания, фенотип которых обусловлен эпигенетическим состоянием генома. Причиной их развития может быть аномальная экспрессия одного единственного гена, как при редких синдромах ломкой Х-хромосомы и Прадера-Вилли, или более распространенные глобальные нарушения регуляции, при которых бесчисленные стохастические и вызванные внешними факторами эпигенетические изменения формируют предрасположенность к заболеванию (Feinberg et al., 2010). Независимо от причины появления эпигенетических изменений, при ряде редких состояний наблюдаемый фенотип на 100% обусловлен эпигенетическими вариациями. К таким феноменам относятся аномалии формирования нервной трубки при глобальном гипометилировании ДНК. Подобные эпигенетические изменения обычно «стираются» при репрограммировании клеток, поэтому моделирование соответствующих состояний с помощью иПСК, скорее всего, невозможно.

Если заболевание не попадает ни в одну из перечисленных категорий, его фенотип является суммарным результатом триады вариаций: генетической, эпигенетической и обусловленной воздействием внешней среды. Наглядным примером является результат воздействия солнечного ультрафиолета, при котором генотип человека, обуславливающий пигментацию его кожи, обеспечивает устойчивость или предрасположенность к ожогам. Кроме того, воздействие ультрафиолетового излучения индуцирует активность генов, продуцирующих пигмент меланин, защищающий кожу от солнечных ожогов. И, наконец, интенсивность и продолжительность воздействия влияет на тяжесть ожога. При моделировании солнечного ожога с помощью репрограммирования клеток для физиологически адекватного воспроизведения фенотипа необходимо учитывать все три фактора.

Ценность моделирования заболеваний с помощью стволовых клеток

Пациентоспецифичное моделирование заболеваний наиболее информативно для болезней, имеющих значимые генетические компоненты

При репрограммировании соматических клеток в плюрипотентные их эпигенетическая история стирается, а стандартизованные условия культивирования нормализуют результаты воздействия факторов внешней среды. При работе с линиями иПСК можно адекватно воспроизвести только один из трех описанных выше факторов развития комплексных заболеваний – генетическую вариабельность (рисунок 3).

Рисунок 3. Адекватность моделирования пациентоспецифичных и индуцированных заболеваний с помощью иПСК

На сегодняшний день ученые уже получили достаточно много клеточных линий, для создания которых у пациентов выделяли соматические клетки, репрограммировали их в иПСК, которые, в свою очередь, дифференцировали в клетки-мишени, поражаемые при анализируемом заболевании. При этом в одних случаях удалось выявить выраженные различия между клетками пациентоспецифичных и контрольных линий, тогда как в других случаях подобные отличия выявлены не были. Единственным полифакторным заболеванием, для которого был получен соответствующий клеточный фенотип, стала шизофрения, наследуемость которой достигает 80% (Cardno et al., 1999). Все остальные проанализированные клеточные фенотипы относятся к генетическим заболеваниям, таким как врожденный дискератоз, синдром ломкой Х-хромосомы, семейная болезнь Паркинсона и другие.

Судя по всему, ценность пациентоспецифичных моделей заболеваний, созданных с помощью иПСК, прямо пропорциональна степени наследуемости патологии. Что же касается полифакторных болезней, этиология которых сочетает три компонента (генетический, эпигенетический и обусловленный воздействием внешней среды), ставка делается на то, что клетки, выделенные у пациентов с высокопенетрантной наследственной предрасположенностью к заболеванию, позволят изучить патологические механизмы его развития.

Моделирование болезней со значимыми эпигенетическими и обусловленными влиянием внешней среды компонентами с помощью стволовых клеток требует экспериментальной индукции заболевания

Несмотря на то, что репрограммирование устраняет эпигенетические и обусловленные воздействием внешней среды причины заболевания, моделирование с помощью стволовых клеток может быть полезно и при изучении не-генетических болезней. В случаях, когда причины развития заболевания относительно хорошо известны, его индукцию можно осуществить непосредственно в культуре. Например, иПСК можно дифференцировать в меланоциты и кератиноциты, образующие модель эпидермиса, которую можно использовать для изучения солнечных ожогов (Lin and Fisher, 2007).

Создание подобных моделей для заболеваний с малопонятной этиологией является гораздо более сложной задачей, подразумевающей воспроизведение условий окружающей среды, эпигенетических изменений и других факторов, потенциально ведущих к появлению искомого фенотипа.

Что в будущем?

Помимо разрабатываемых в настоящее время методов моделирования заболеваний и скрининга лекарственных препаратов возможность превращения клеток одного типа в другой вселяет в клиницистов надежду на появление новых терапевтических возможностей. В основе огромного количества заболеваний лежит отсутствие каких-либо важных клеток или белков, поэтому надежда на их излечение путем замещения недостающего компонента возлагается на клеточную инженерию и регенеративную медицину.

Этого можно добиться с помощью двух основополагающих подходов: (1) создания иПСК и их дифференцировки в клетки-мишени для последующего введения пациенту или (2) непосредственного превращения здоровых клеток в отсутствующие или поврежденные клетки с целью запуска процесса регенерации внутри организма.

Первый подход во многом сходен с методиками, применяемыми в настоящее время для моделирования заболеваний, тогда как второй требует проведения манипуляций над тканевой принадлежностью клеток в условиях организма. Ученым же удалось добиться обнадеживающих результатов при попытках превращения экзокринных клеток поджелудочной железы в инсулинсекретирующие бета-клетки с помощью вирусных векторов, экспрессирующих необходимые гены (Zhou et al., 2008). В отличие от введения иПСК, метод непосредственной конверсии не ассоциирован с риском сохранения остаточных плюрипотентных клеток в организме. Однако его применение связано с другими сложностями: необходимостью прицельной доставки терапевтических агентов и предотвращения появления частично трансформированных и злокачественных клеток.

Помимо экспериментальных и, возможно, терапевтических инструментов, манипуляции над тканевой принадлежностью клеток могут предоставить специалистам новые методы изучения таких патологий, как метаплазия, неоплазия и нарушения развития. По сути предложенные Yamanaka факторы репрограммирования – Oct4, Sox2, KLF4 и Myc – являются мощными онкогенами, а процесс репрограммирования – аналогом дедифференцировки, которую предположительно претерпевают клетки некоторых опухолей. Поэтому изучение этих механизмов может помочь разобраться в механизмах озлокачествления клеток.

Заключение

Разработка метода репрограммирования клеток и осознание того, что клеточная принадлежности пластична и может быть объектом манипулирования, привела к появлению у исследователей смелых мыслей о новых подходах к изучению механизмов развития заболеваний, а также разработке новых препаратов и методов клеточной терапии ряда болезней. Однако в основе многих заболеваний лежат значимые эпигенетические и обусловленные воздействием внешней среды компоненты, поэтому очевидно, что в обозримом будущем пациентоспецифичные модели заболеваний, созданные с помощью стволовых клеток, наиболее информативны для патологий с высокопенетрантной генетической этиологией. Однако первая волна моделей должна помочь специалистам разобраться в том, какие аспекты патофизиологии можно, а какие нельзя изучать на подобных клеточных моделях. Использование плюрипотентных стволовых клеток для моделирования заболеваний с незначительными генетическими компонентами может иметь смысл, однако оно, несомненно, связано с серьезными сложностями. Одной из задач в данном случае является воспроизведение влияния эпигенетики и внешней среды таким образом, чтобы комплекс соответствующих генетических и негенетических факторов обеспечил получение адекватного фенотипа заболевания in vitro. Учитывая скорость развития современной науки и появления публикаций, описывающих основанные на иПСК модели заболеваний, в скором будущем специалисты должны сформулировать принципы, которые приблизят исследовательскую работу к клинической практике.

Список использованной литературы приведен в отдельном файле.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru

15.06.2012