Обман длиной в десятилетия

В статьях о механизме развития болезни Альцгеймера обнаружены систематические фальсификации

Георгий Куракин, «Элементы»

Вскрылся научный обман длиной в десятилетия — ученый-нейробиолог систематически фальсифицировал данные о роли бета-амилоида в развитии болезни Альцгеймера. Сразу два независимых анализа изображений показали, что автор просто «подрисовывал» нужные ему полоски бета-амилоида на результатах электрофореза белков. Возможно, это заставит пересмотреть ведущую теорию возникновения этой болезни.

Комки и клубки

«Я теряюсь во дворе собственного дома. Я не знаю, куда шел, и забываю, как вернуться домой. <...> Пока мне удавалось вернуться обратно. <...> Меня пугает не незнание, а вопрос о том, когда я дойду до той черты, переступив которую, уже не смогу вернуться». Так описывает свои симптомы один из героев документального сериала «Проект «Альцгеймер»: Записи потерянной памяти» (The Alzheimer's Project). Болезнь Альцгеймера — самая распространенная причина деменции в пожилом возрасте. На ее долю приходится от 60 до 80% случаев старческого слабоумия, а по статистике США, более 10% людей в возрасте более 65 лет страдают этой болезнью.

Приведенная выше цитата хорошо описывает, насколько страшна болезнь Альцгеймера — ее неуклонное прогрессирование неизбежно приводит человека к полной утрате сознания, личности, способности общаться и обслуживать себя. И к смерти, если он за это время не умирает от других причин. Такая клиническая картина напоминает другую группу заболеваний — прионные болезни, развивающиеся из-за неправильной укладки белков в нейронах мозга. Отличие лишь в том, что болезнь Альцгеймера развивается куда медленнее, и ею невозможно заразиться.

Сходство это не случайно. Давно известно, что болезнь Альцгеймера тоже связана с неправильной структурой белков, и прежде всего — белка APP, расположенного на мембранах нейронов. У этого белка много функций — например, он участвует в формировании синапсов и защите от инфекций. Его расщепляют ферменты α-, β- и γ-секретазы, что приводит к образованию пептидов различной длины в зависимости от точки расщепления. Некоторые из этих пептидов способны слипаться в плотные комки (правильнее называть их бляшками), которые при окраске гистологическими красителями напоминают зерна крахмала (рис. 1). Поэтому вещество этих бляшек называется амилоидом (от греческого слова ἄμυλον — крахмал).

Рис. 1. Амилоидные бляшки в мозге людей, погибших от болезни Альцгеймера, хорошо видны даже при рутинном гистологическом окрашивании и действительно выглядят как крахмалоподобное плотное вещество, из-за чего и получили свое название. Изображение с сайта commons.wikimedia.org.

Амилоид откладывается вне нейронов, в межклеточном пространстве. Когда этого белкового «мусора» накапливается слишком много, нервные клетки начинают гибнуть.

Так как амилоидов много (и образовываться они могут не только из APP и не только в мозге), образующийся из APP амилоид называют бета-амилоидом, или Aβ. Собственно, название самого белка APP расшифровывается как Amyloid-beta precursor protein — белок-предшественник бета-амилоида.

Роль этого белка в развитии болезни изучена больше всего — во-первых, бета-амилоид (как уже было сказано) хорошо виден под микроскопом при патологоанатомическом исследовании. Во-вторых, все семейные формы болезни Альцгеймера с ранним началом вызываются мутациями в гене APP или в генах его метаболизма (кодирующих белки пресенилин-1 и пресенилин-2).

Но фатальная последовательность событий в мозге не заканчивается на бета-амилоиде (рис. 2). Внутри самих нейронов другой белок начинает укладываться неправильно. Речь идет о тау-белке, который в норме стабилизирует микротрубочки. Они, как рельсы, проходят внутри длинных отростков нейронов (аксонов), и по ним вдоль аксонов транспортируются различные вещества. При болезни Альцгеймера тау-белок начинает спутываться в клубки, и функционирование мозга становится похоже на работу железной дороги со строительным мусором на рельсах через каждый километр. В процесс также вступает нейромедиатор глутамат — он неконтролируемо высвобождается и чрезмерно активирует свои рецепторы, что приводит к гибели клетки.

Рис. 2. В основе болезни Альцгеймера лежит нарушение структуры белков головного мозга — белок APP образует амилоидные бляшки, а тау-белок спутывается в клубки. Это приводит к гибели нейронов и неуклонной утрате когнитивных функций. Рисунок с сайта biorender.com, с изменениями.

На сегодняшний день наиболее обоснованной считается точка зрения, что бета-амилоид является первопричиной всех нарушений, и именно накопление бляшек бета-амилоида вне нейронов запускает каскад патологических изменений внутри них, включающий и спутывание тау-белка в клубки, и утечку глутамата... Такая теория называется теорией амилоидного каскада.

Сходство бета-амилоида и клубков тау-белка с прионами заключается не только в их форме и клинической картине заболевания, но и в кинетике процесса (J. M. Nussbaum et al., 2012. Alzheimer disease). По всей видимости, бета-амилоид и на молекулярном уровне ведет себя как прион — если в мозге формируются небольшие агрегаты бета-амилоида, они далее служат «ядрами конденсации», индуцируя переход других APP-пептидов в амилоидную форму и их дальнейшее «прилипание» к зародившемуся агрегату. Подобное происходит и с тау-белком. Разница лишь в том, что заразиться болезнью Альцгеймера через поедание мозга умерших от этой болезни (как куру и болезнью Крейтцфельдта — Якоба), по всей видимости, нельзя.

Тем не менее, некоторые сомнения у ученых все же иногда возникают — не в последнюю очередь, связанные с открытием неожиданных звеньев и факторов патогенеза, которые пока не встраиваются в теорию амилоидного каскада, как лишняя деталька в паззл. Например, определенные аллели гена аполипопротеина E увеличивают риск болезни Альцгеймера. Сюрприз в том, что основная функция этого белка — участие в транспорте холестерина. Таким образом, оказывается, что холестерин тоже как-то «причастен» к развитию болезни Альцгеймера. Но каким образом — пока неясно. В общем и целом, сомнения касаются того, является ли накопление бета-амилоида ведущим звеном патогенеза заболевания, или же его запускают какие-то другие механизмы, как, например, нарушение обмена холестерина или даже инфекции и воспаление!

Последнее предположение получило вторую жизнь в свете одной недавней работы — на органоидах мозга ученым удалось показать возможную роль самых банальных вирусов в запуске болезни Альцгеймера (D. M. Cairns et al., 2022. Potential Involvement of Varicella Zoster Virus in Alzheimer’s Disease via Reactivation of Quiescent Herpes Simplex Virus Type 1). Речь идет о вирусе простого герпеса 1 типа (ВПГ-1, том самом, который вызывает «простуду на губах») и вирусе ветряной оспы (вызывающем «ветрянку», чаще всего у детей). Об эти вируса «любят» заражать нервные клетки. Поодиночке они не вызывают в них изменений, характерных для болезни Альцгеймера, но вот если вирус ветряной оспы заразит нейроны, в которых уже «поселился» ВПГ-1 (что называется суперинфекцией), это приводит к быстрому отложению бета-амилоида и формированию клубков тау-белка. Таким образом, болезнь Альцгеймера может иметь и инфекционное происхождение.

Вопрос о патогенезе болезни очень важен, так как, не зная его в деталях, мы практически лишены шанса на разработку хоть сколько-нибудь действенного лекарства от нее. Сейчас для ее лечения применяются препараты, влияющие на действие нейромедиаторов (например, ривастигмин и мемантин). Они способны немного замедлить ухудшение памяти и мышления, но не предотвратить гибель нейронов, — поэтому со временем они теряют эффективность. Ученые не оставляют попыток создать лекарство, направленное на сам механизм развития болезни Альцгеймера — и в основном «целятся» именно в бета-амилоид.

Копировать-вставить

В 2006 году молодой нейробиолог Сильвен Лесне (Sylvain Lesné, на снимке) с соавторами публикует в журнале Nature статью A specific amyloid-β protein assembly in the brain impairs memory, которая в то время показалась научному сообществу революционной. Уже тогда было понятно, что на тканевом уровне болезнь Альцгеймера связана с накоплением амилоидных бляшек, но какова именно роль бета-амилоида — не было до конца ясно.

Лесне с коллегами утверждали, что обнаружили олигомеры бета–амилоида с частицами массой 56 кДа, которые они коротко назвали Aβ*56. В первой статье постулировалось, что введение такого амилоида подопытным грызунам способствовало развитию у них изменений, которые у человека характеризовали болезнь Альцгеймера. Ну точь-в-точь прион! В последующих статьях тема Aβ*56 развивалась, но неизменным оставался один посыл: эти 56-килодальтонные олигомеры являются первопричиной всех молекулярных бед, постигающих нейроны заболевших.

Основным методом обнаружения белковых агрегатов заданной молекулярной массы в работах Лесне был вестерн-блоттинг (western blotting) — электрофорез белков с детекцией антителами. Проще говоря, белки различной молекулярной массы «разгонялись» в электрическом поле, образуя полосы в полиакриламидном геле. Конечно, изображения таких электрофореграмм включались в каждую статью. Статьи Лесне цитировались тысячи раз, и никто не заподозрил неладное, пока все не вскрылось случайным образом.

История разоблачения началась с того, что одному адвокату понадобилась помощь эксперта в щекотливом процессе против фармацевтической компании, запустившей в продажу препарат симуфилам. Клиенты адвоката — нейробиологи — пытались оспорить результаты исследований препарата и заявляли, что они сфальсифицированы. Адвокат позвонил Мэттью Шрэгу (Matthew Schrag) — нейробиологу и психиатру из Университета Вандербильта — и привлек его в качестве эксперта. Шрэгу удалось установить, что фальсификации действительно были. Но попутно он нашел еще кое-что интересное.

В целях экспертизы он посетил сервис постпубликационного рецензирования PubPeer, где ученые могут оставлять комментарии к работам своих коллег. Он искал статьи по болезни Альцгеймера, к которым были бы написаны критические комментарии. Но его внимание привлекли не только статьи по симуфиламу. Оказалось, что работы Лесне тоже «популярны» — коллеги оставляли на сервисе многочисленные сомнения в достоверности опубликованных им изображений вестерн-блоттинга белков. Шрэг заинтересовался и решил провести детальный анализ этих изображений, чтобы выявить признаки «подрисовки».

Он подверг компьютерному анализу архив публикаций Лесне за много лет, совмещая части изображений одну с другой. В результате в статьях нейробиолога обнаружились многочисленные точные совпадения полосок в разных местах, которые нельзя было объяснить случайным совпадением. Дело в том, что при вестерн-блоттинге полоски белков образуют «кляксы» с неровными краями, форма которых в значительной степени случайна. Точные совпадения могли указывать лишь на одно — Сильвен Лесне «подрисовал» часть полосок методом копирования-вставки на компьютере. «Подрисовка» локализовалась именно в области, отнесенной исследователем к Aβ*56. На рис. 3 наглядно объясняется методика выявления скопированных фрагментов на изображениях, которой пользовался Шрэг.

Рис. 3. Как определить, что данные на электрофореграмме сфальсифицированы путем копирования: пошаговая инструкция на примере картинки-модели из редактора GIMP. а) Я нарисовал картинку, похожую на электрофореграмму, нанося полоски «от руки». Примерно такой же вид будут иметь пятна на реальных электрофореграммах. б) Для экономии сил часть полосок просто скопирована из ряда в ряд. Удастся ли вам определить, что я вас обманул? в) Обнаружив какие-то подозрительные совпадения в двух рядах, вы их выделяете, делаете из изображения цифровой негатив и раскрашиваете ряды красным и зеленым. Затем совмещаете ряды друг с другом в таком режиме, чтобы цвета при наложении комбинировались. г) Скопированные полосы совпадут полностью и будут монотонно желтыми из-за наложения красного и зеленого. Полосы, полученные добросовестно, будут иметь различные края — поэтому полного совпадения не получится. Будет наблюдаться красно-желто-зеленая «клякса». Такие действия повторяются много раз с разными изображениями. Большое количество подобных совпадений, скорее всего, указывает на масштабную фальсификацию и ставит опубликованные результаты под сомнение. Рисунок Григория Куракина.

Кому теперь верить?

Описание выводов Шрэга было опубликовано в недавнем выпуске журнала Science и на какое-то время стала одной из главных новостей научного сообщества. Прежде чем публиковать результаты этого расследования, Science привлек еще двух экспертов по анализу изображений, которые перепроверили электрофореграммы Лесне и в целом подтвердили доводы Шрага. Масштабная фальсификация длиной во много лет действительно была.

Это беспрецедентный объем аналитической работы по выявлению фальсификаций в научных исследованиях, который когда-либо публиковался в Science. Андрей Заякин — российский физик и член сообщества «Диссернет», занимающегося выявлением научных фальсификаций в России, — прокомментировал это так: «Объем работы Шрэга потрясает — его можно назвать «Диссернетом из одного человека», через его руки прошли сотни полосок».

Вслед за расследованием Шрэга стали всплывать и другие неудобные подробности об амилоиде Aβ*56. Выяснилось, что его вообще никто не смог выделить! Но лишь одна группа исследователей опубликовала такие отрицательные результаты (G. M. Shankar et al., 2008. Amyloid β-Protein Dimers Isolated Directly from Alzheimer Brains Impair Synaptic Plasticity and Memory). Просто потому, что отрицательные результаты публикуются гораздо реже положительных. На момент публикации никто не обратил внимания, что Aβ*56 почему-то не найден.

Так что же теперь — гипотеза амилоидного каскада оказалась ошибочной? Пока такие выводы делать преждевременно. Сами представления о бета-амилоиде как о важнейшем пусковом факторе болезни Альцгеймера «держались» не только на работах Лесне и его мифическом Aβ*56: слишком много улик в пользу виновности бета-амилоида, от генетики до микроскопии. Мы теперь лишь знаем, что конкретно Aβ*56 выдуман и нарисован, — но возможную роль других форм бета-амилоида равно списывать со счетов. Даже другие олигомеры могут играть ту роль, которую Лесне приписал плоду своего воображения. Сам Шрэг говорит, что «более широкая история с олигомерами амилоида, возможно, переживет эту проблему, но следует задуматься об истоках этой ситуации».

Случившееся действительно заставляет задаться более важным вопросом: насколько мы можем верить науке и как наука может защититься от таких историй в будущем? От подобных манипуляций могла бы спасти тщательная проверка изображений и данных статьи перед публикацией, но пока неизвестно, смогут ли редакции научных журналов выработать какой-то общий стандарт и ему следовать (хотя призывы к этому звучат не в первый раз).

Моралью всей этой истории может послужить фраза Мэтью Шрэга из интервью в журнале Science: «Вы можете обманом опубликовать статью. Вы можете обманом получить степень. Вы можете обманом выиграть грант. Но вы не сможете обманом вылечить болезнь. Биологии все равно».

Источник: C. Piller. Blots on a field? // Science. 2022

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru