Аккуратные ножницы
На терапевтический потенциал инструмента редактирования генома CRISPR-Cas9 возлагаются большие надежды. Эти «генетические ножницы» могут быть использованы для иссечения и восстановления мутированных генов, ответственных за наследственные заболевания. Но, несмотря на точность, с которой инструмент способен определять свою мишень в геноме, иногда разрезы делаются в участках, которые очень похожи на целевую последовательность, но расположены в совершенно других областях ДНК. Эти нецелевые мутации могут иметь неожиданные последствия. И даже если CRISPR-Cas9 делает разрез в правильном месте, при восстановлении нитей ДНК могут возникнуть ошибки – так называемые нецелевые мутации.
Расстояние между разрезами
Ошибки возникают в основном из-за того, что при классическом варианте CRISPR-Cas9 разрезаются сразу обе нити ДНК. Исследователи из Берлинского центра молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка Ассоциации Гельмгольца и Университета Гумбольдта в Берлине представили новый усовершенствованный подход – метод разделения spacer-nick. В нем используется модифицированная пара молекулярных ножниц – фермент никаза, который делает надрезы в двух разных точках на противоположных нитях ДНК. Это гарантирует, что два надреза расположены на расстоянии от 200 до 350 пар оснований друг от друга и поможет избежать двухцепочечных разрывов в ДНК. Эксперименты с гемопоэтическими стволовыми клетками и Т-лимфоцитами показали, что это оптимальное расстояние для минимизации нецелевых мутаций.
Эффективно и безошибочно
Ученые количественно сравнили эффективность редакторов генома. С помощью классического метода CRISPR-Cas9 нецелевые мутации встречались более чем в 40% вмешательств, система spacer-nick снизила этот показатель до 2%. Количество нецелевых мутаций определить гораздо сложнее, но исследователи отметили, что они происходили относительно часто при использовании классических генетических ножниц, а при редактировании spacer-nick были редкими или вообще отсутствовали.
Неясным остается точный механизм, с помощью которого генетический материал восстанавливается после разрезов с помощью никазы.
С точки зрения эффективности spacer-nick не уступает обычному CRISPR-Cas9: оба метода позволяют успешно восстановить 20-50% обработанных клеток. Вероятно, этого достаточно, чтобы вылечить пациентов с наследственным заболеванием, которое связано только с одним измененным геном, например бета-талассемию, которая связана с неправильным синтезом гемоглобина, или тяжелую врожденную нейтропению, которая характеризуется значительно уменьшенным количеством гранулоцитов.
Авторы надеются, что другие исследователи подхватят их идею и протестируют spacer-nick сначала на животных моделях, а вскоре и на первых пациентах-людях. Принцип, лежащий в основе терапии, прост: гемопоэтические стволовые клетки берутся у людей с моногенным наследственным заболеванием, затем spacer-nick восстанавливает дефектные гены непосредственно в клеточной культуре. Как только генетические ножницы сделают свою работу, восстановленные стволовые клетки вводятся обратно пациенту, где они производят новые и, что самое главное, здоровые клетки крови.
Статья N.Tung Tran et al. Precise CRISPR-Cas–mediated gene repair with minimal off-target and unintended on-target mutations in human hematopoietic stem cells опубликована в журнале Science Advances.
Аминат Аджиева, портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам EurekAlert: A fine-tuned gene editor.