Аптамеры для диагностики рака
Найдут и обезвредят
Наталия Булгакова, «Поиск» № 21-2015
Началось все с того, что Татьяна Замай, профессор Сибирского федерального университета (СФУ), поехала на стажировку в Канаду, где познакомилась с профессором Максимом Березовским, кстати, выпускником Новосибирского госуниверситета, ныне работающим в Университете Оттавы. Одна из тем возглавляемой им исследовательской группы – развитие биосенсоров на основе аптамеров – очень ее заинтересовала. В России в то время никто ничем подобным не занимался. Почему бы не начать развивать это направление в Красноярске?
Сложилось сотрудничество. Татьяна Замай, вернувшись в родной сибирский город, увлеченно приступила к освоению новой научной области. Показалась привлекательной тема аптамеров и ее дочери, Анне Замай, выпускнице физфака Красноярского госуниверситета по специальности «Биофизика». Шел 2009 год. На средства индивидуального молодежного гранта Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности были куплены первые реактивы и все необходимое для начала исследований. И работа пошла.
Сегодня Анна Замай – доктор биологических наук, руководитель Лаборатории биомолекулярных и медицинских технологий Красноярского государственного медицинского университета (КрасГМУ) им. В.Ф.Войно-Ясенецкого. Кроме того, она ведущий технолог лаборатории 2.1 Института химии и химической технологии Сибирского отделения РАН (ИХХТ СО РАН) и руководитель проекта, поддержанного Минобрнауки РФ в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы». Тема этого проекта звучит так: «Разработка мультиплексных электрохимических сенсорных систем на основе наночастиц благородных металлов и ДНК-аптамеров для диагностики рака легкого», шифр по лоту 2014-14-576-0114.
Аптамеры – синтетические одноцепочечные молекулы РНК или ДНК, способные связываться с желаемыми мишенями. Иначе говоря, одноцепочечная молекула ДНК образует трехмерную структуру, напоминающую кольцо с отходящими от него «хвостами» разной длины. Вот ими-то она и «связывается» с участками молекулы того или иного белка. От последовательности образующих молекулу ДНК олигонуклеотидов зависит конформация (геометрические формы, которые могут принимать молекулы) аптамера, а значит, и его сродство к мишени (то есть сила связывания с молекулой выбранного исследователем белка). Подобрав нужную последовательность из большой библиотеки аптамеров, ученые получают те, что им нужны, например те, что связываются с клетками злокачественных опухолей. Селекция – дело, прямо скажем, не из легких: ведь такая библиотека включает в себя 10 в 12-й степени различных последовательностей (видов аптамеров), а для решения поставленной задачи подходят лишь единицы. Аптамеры называют «цифровыми лекарствами»: на их основе можно изготавливать диагностические и терапевтические препараты. За рубежом исследования в этой области начались в конце 1990-х годов, и они считаются очень перспективными.
– Все знают про белковые антитела, их используют при диагностике в лабораториях, – объясняет Анна Замай. – ДНК-аптамеры – аналоги белковых антител. По функциональным характеристикам они абсолютно одинаковы. Даже по особенностям работы очень похожи. Однако аптамеры имеют несколько преимуществ: белок требовательный к условиям хранения, дорогой в производстве. А аптамеры с известной последовательностью нуклеотидов можно легко и довольно дешево синтезировать в любых количествах. Можно модифицировать их флуоресцентными или другими метками – тогда, связавшись с клеткой опухоли, аптамер выдаст ее присутствие свечением. Можно присоединять к нему лекарства и обеспечивать адресность их доставки. Например, препараты для лечения заболеваний мозга имеют очень нежелательные побочные эффекты, а использование аптамеров позволяет доставить лекарство точно к пораженным тканям и снизить негативное воздействие на здоровые клетки за счет уменьшения концентрации препарата.
– Каким образом вы отбираете нужную последовательность?
– Если мы подбираем аптамеры к опухолевой ткани, сначала берем клетки крови здорового человека и здоровую ткань. Мы не хотим, чтобы аптамеры с ними связывались. Инкубируем с этими клетками библиотеку аптамеров. Те аптамеры, что связались со здоровыми клетками, нам не нужны, и мы их отделяем. Оставшиеся аптамеры инкубируем с клетками рака. Убираем несвязавшиеся аптамеры, а те, что связались, оставляем. Увеличиваем количество их амплифицированных копий. При амплификации олигонуклеотидов появляются случайные изменения в последовательности, необходимые для осуществления направленной «эволюции в пробирке».
Делаем несколько таких раундов, идем раз 10-15 по этому кругу. И дальше проверяем, в каком раунде у нас получились аптамеры, которые лучше всего связываются с желаемыми мишенями – раковыми клетками – и не связываются с остальными клетками. Можно аналогично проверить полученные аптамеры к клеткам других видов опухоли. Чем строже негативная селекция, тем лучше получаются аптамеры.
Дальше проводим секвенирование, узнаем последовательности нуклеотидов во всех аптамерах, присутствующих в этом пуле. Раньше использовали более простой метод клонирования, картина была не совсем полной. Сейчас мы делаем полногеномное секвенирование и получаем абсолютно все последовательности. Выбираем методами биоинформатики целые семейства аптамеров, а из них те, которые встречаются чаще: значит, они лучше связываются с клетками мишени.
В ходе проектов, поддержанных грантами ФЦП «Исследования и разработки» в прошлые годы, в лаборатории были получены аптамеры к ткани рака легкого человека, которые позволяют идентифицировать клетки и продукты распада опухоли в клинических образцах. Если аптамерами окрасить опухолевую ткань, под микроскопом хорошо различимы скопления раковых клеток и здоровые участки.
О возникновении онкозаболевания можно судить по появлению в крови онкомаркеров – белков, характерных для того или иного ракового заболевания. Однако наличие опухоли невозможно определить только по одному-единственному белку. Да и концентрация очень многих известных биомаркеров в крови разных пациентов даже с одним и тем же диагнозом сильно варьирует. У одного страдающего раковым заболеванием эта концентрация очень высокая, у другого – низкая, но это не значит, что у него нет рака! И болезнь можно упустить. Поэтому сейчас ученые пришли к тому, что для более точной диагностики необходим комплекс различных биомаркеров – сигнатура. Однако не все онкомаркеры, что применяются сейчас, обладают достаточной специфичностью, то есть у них отсутствует строгая избирательность по отношению к мишеням, с которыми они связываются. Мультиплексная система с использованием шести аптамеров, полученных к опухолевой ткани, позволит диагностировать рак более точно.
Сейчас, на втором этапе выполнения проекта, биологи проводят селекцию аптамеров к шести стандартным белкам-онкомаркерам, выбирают лучший пул. Параллельно ведут свои исследования химики. И уже есть результаты. Идею подсказала портативная электрохимическая станция – прибор размером чуть больше сигаретной коробки, привезенный из Испании. Принцип его действия следующий: при связывании белков-онкомаркеров плазмы крови пациента с аптамерами, «сидящими» на золотом электроде, изменяется сопротивление биосенсорной поверхности. Информация выводится на монитор компьютера, и по ней можно судить о наличии заболевания. Но испанская электрохимическая станция, отмечает А.Замай, базируется только на одном биосенсоре. Кроме того, погрешность, с которой она выдает результат, достаточно большая для точных исследований, которые ведутся в лаборатории. Взяв за основу принцип действия этого прибора, красноярцы хотят сделать его усовершенствованный аналог – для мультиплексной детекции сигнатуры из шести стандартных белков-онкомаркеров и шести новых кандидатов в биомаркеры рака легкого. Вот такое импортозамещение.
– Рак – индивидуальное заболевание; одинаковая по названию опухоль на самом деле у каждого своя, – поясняет Анна Замай. – У кого-то из больных одних белков-биомаркеров больше, у кого-то – других. Поэтому для того, чтобы поставить точный диагноз, необходимо комплексное исследование. И, соответственно, мультиплексный биосенсор.
Принцип работы электрохимического биосенсора для диагностики онкозаболеваний на основе ДНК-аптамеров
Поскольку работа проводится в тесном сотрудничестве с врачами-онкологами Красноярского краевого онкологического диспансера им. А.И.Крыжановского, ученые точно знают, какой результат нужен для использования в клинической практике.
К третьему этапу проекта, на котором предстоят секвенирование и синтез аптамеров, мультиплексный сенсор, как ожидается, уже будет готов, и можно будет проводить его испытания.
Для решения сложной задачи диагностики рака легкого в Красноярске объединились не только ученые и специалисты из многих отраслей науки и направлений практической деятельности – биологи, медики, химики, хирурги, инженеры, есть даже математик, но и разные организации. В начале апреля этого года было подписано соглашение о совместной деятельности по разработке и обеспечению производства биосенсорных тест-систем для диагностики онкологических заболеваний на основе ДНК-аптамеров между КрасГМУ им. В.Ф.Войно-Ясенецкого, Краевым онкологическим диспансером им. А.И.Крыжановского (далее – онкодиспансер), Красноярским научным центром СО РАН, Институтом химии и химических технологий СО РАН, Институтом физики СО РАН и КБ «Искра».
– В чем особенность наших исследований? Мы выбираем аптамеры именно к тканям, – говорит А.Замай. – Из онкодиспансера в лабораторию поступают образцы опухолевых тканей после операций, и мы ищем аптамеры непосредственно к ним. Этический комитет прошли, тут все нормально. В России получением новых аптамеров по-прежнему занимаются мало, изучение их, в основном, идет с позиций фундаментальной науки и пока без видимого практического выхода. За границей в подобных исследованиях используют белки или клеточные культуры: получив от какого-то пациента колонию клеток, многократно ее культивируют. Конечно, полученная после длительного культивирования клеточная линия уже сильно отличается от клеток первоначальной опухоли. Мы же, повторюсь, работаем на свежем послеоперационном материале. Аптамеры, которые мы получаем, очень часто – мы проверяли! – не связываются с культурами, зато очень хорошо связываются с больными клетками – и циркулирующими в крови, и выделенными из опухоли. И наоборот, аптамеры, полученные для культур, плохо работают на клинических образцах.
Как только будет готов и сертифицирован прибор, созданы наборы реактивов, онкодиспансер готов сразу начать внедрение. Ждут с нетерпением! Прибор будет изготавливать КБ «Искра», которое специализируется на разработке систем спутниковой связи. Уже готовят «чистые комнаты», необходимые для производства.
– Современная наука не делается в изоляции. Результаты получаются, только когда люди кооперируются, – говорит Татьяна Замай, ведущий сотрудник Лаборатории биомолекулярных и медицинских технологий КрасГМУ. – Если человек сидит и в собственном соку варится – практических результатов не будет. Когда мы получили первые аптамеры, у нас не было никаких возможностей создать биосенсоры на их основе. Ни оборудования, ни людей, которые в этом понимают. В России колыбелью аптамеров стал Красноярский медуниверситет, где нас приняли со всеми нашими, как казалось многим, авантюрными идеями. Госзаданиями Минздрава России была поддержана разработка методов медицинской диагностики рака легкого и сальмонеллеза. На масс-спектрометре высокого разрешения был начат поиск белков-онкомаркеров и мишеней для терапии. Но только когда мы скооперировались со специалистами в области химических технологий получения гибридных наночастиц, физики наноструктур и магнитных явлений, математики и инженерии, дело действительно двинулось. И теперь мы работаем большой дружной командой, нас поддерживают и руководство Медуниверситета, и руководство Красноярского научного центра, и наши канадские коллеги, которые очень помогают с оборудованием и реактивами. Большим подспорьем стала поддержка наших проектов в рамках ФЦП «Исследования и разработки». Полученные результаты привлекли внимание индустриальных партнеров: в работу над созданием аппаратно-программного обеспечения мультиплексных электрохимических сенсорных систем включились инженеры и производственники КБ «Искра». Сейчас готовимся к переезду – ректор выделил под лабораторию просторное специальное помещение.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
05.06.2015