Настоящие слёзы

Выращенный in vitro органоид слезной железы успешно прижился у крысы

Исмаил Юнусов, N+1

Японские биологи вырастили и успешно пересадили крысе органоид слезной железы из мультипотентных эпителиальных клеток глаза. Этот органоид имеет сходство со слезными железами по морфологии, иммунным маркерам и экспрессии определенных генов.

Статья Hayashi et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells опубликована в журнале Nature.

Слезная железа — главная экзокринная железа глаза. Она секретирует слезную жидкость — важнейший компонент слезной пленки и различные защитные белки, например, лактоферрин, лизоцим, которые участвуют в противомикробной защите.

Клетки слезной железы плода способны к регенерации, однако у взрослых людей эта активность минимальна. Изучать эту железу трудно, потому что орган недоступен для биопсии и выделения клеток. Поэтому железа выступает мишенью для разработки лекарств и исследований в области регенеративной терапии.

Рюхэй Хаяси (Ryuhei Hayashi) и Тору Окубо (Toru Okubo) из Высшей медицинской школы Университета Осаки в 2017 году вместе с коллегами рассказывали о созданном ими органоиде глаза — SEAM (self-formed ectodermal autonomous multi-zone). SEAM частично повторял механизмы развития настоящего глаза и содержал клетки-предшественники для клеточных линий глаза. Теперь они опубликовали статью, в которой рассказывают об органоиде слезной железы, выращенном из клеток SEAM.

Развитие желез на 4, 15 и 39 день. Рисунок из статьи в Nature.

После этого исследователи решили узнать какие именно клетки из третьей зоны SEAM являются предшественниками органоида слезной железы. Для этого они использовали метод проточной цитометрии с добавлением антител, которые взаимодействуют со стволовыми эпителиальными клетками глаза (анти-ITGB4, анти-SSEA-4 и анти-CD200). Анализ показал, что 90 процентов клеток отрицательны к CD200, в то же время 60 процентов положительны к ITGB4, и SSEA-4. В совокупности эти характеристики относятся к стволовым эпителиальным клеткам глаза. Поэтому исследователи пришли к выводу, что клетки, которые сформировали органоид слезной железы, относятся к линии стволовых эпителиальных клеток глаза. После этого авторы провели анализ всего SEAM и получили следующие результаты: приблизительно 70 процентов были положительны к CD200, и из оставшихся CD200– выделили четыре популяции клеток.

Эти популяции затем перенесли на среду для дальнейшего культивирования, и среди всех них только одна сформировала многоотростчатую форму. Поэтому исследователи решили, что эта клеточная линия является предшественником для органоидов слезных желез.

После подбора оптимальной среды для почкования и ветвления желез из этой клеточной линии исследователи провели анализ одноцепочечной РНК этих клеток. Он показал, что на 20 день развития клетки начали синтезировать функциональные белки слезных желез: липокалин-2 и β-дефензин. Кроме этого, сформировались крупные скопления клеток, таких как миоэпителиальные, ацинарные и протоковые.

Чтобы проверить гипотезу о том, что предшественники слезной железы, развились из стволовых эпителиальных клеток глаза, биологи провели покадровую микроскопию для наблюдения за формированием колоний и выявили две формы клеток: плоские и куполообразные. Исследуя гены связанные с развитием желез, исследователи поняли, что они в большей степени экспрессируются в куполообразных клетках. Также нокаут одного из этих генов показал снижение почкования и ветвления в железах. Обратная ситуация наблюдалась в плоских клетках: там в большей степени обнаруживались маркеры клеток предшественников роговицы. Эти данные указывают на то, что первоначальная гипотеза о происхождении предшественников слезной железы была верна.

После того как исследователи вырастили органоид слезной железы, они трансплантировали его в соединительную ткань рядом с глазом крысы(ее слезная железа была предварительно удалена). Через четыре недели после операции, пересаженный органоид сохранился и сформировал структуры похожие на протоки. В отличие от органоидов, выращенных in vitro, пересаженные показали четкое формирование протоков на второй неделе, а на четвертой они стали более выраженными.

Лактоферрин продуцирующие клетки, которые не могли быть замечены in vitro, были обнаружены в некоторых частях пересаженного органоида. Анализ экспрессии генов после трансплантации показал, что у пересаженных по сравнению с не пересаженными экспрессия генов LYZ и LTF (кодируют белки слезной пленки), выросла в 3000 раз.

На основании полученных данных биологи пришли к выводу, что уровень экспрессии определенных генов и маркеров у пересаженного органоида и нативной слезной железы одинаковый.

По словам авторов статьи, полученные данные и успешная трансплантация открывают перспективы для исследований развития слезной железы и лечения некоторых заболеваний, например, синдрома Шегрена. Кроме этого, такие выращенные органоиды могут применяться в разработке лекарств и исследования патологий слезных желез.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru