Новый шаг
Индуцированные плюрипотентные клетки помогут спасти носорога
Евгения Костина, PCR.news
Международный консорциум BioRescue на шаг приблизился к спасению северного белого носорога, которому угрожает вымирание. Команда из Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка вместе с партнерами из Мюнхена, Нидерландов и Японии получила из фибробластов кожи носорога плюрипотентные стволовые клетки в наивной стадии.
Северный белый носорог Ceratotherium simum cottoni — один из двух подвидов белого носорога — считается находящимся под угрозой исчезновения, возможно, вымершим в дикой природе. Фату и Наджин — по-видимому, последние два северных белых носорога в мире, и обе они самки. Таким образом, этот подвид больше не может размножаться естественным путем, и вымирание кажется неизбежным. Однако консорциум BioRescue старается предотвратить его. Для этого ученые совершенствуют вспомогательные репродуктивные технологии и, в частности, планируют создать из клеток кожи северного белого носорога индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые в итоге могут развиться в клетки-предшественники яйцеклеток (ооцитов). Эти яйцеклетки можно оплодотворить спермой другого подвида и пересадить суррогатной матери, таким образом удастся быстрее восстановить численность угрожаемого вида.
Но сначала необходимо решить технические проблемы. Генерация гамет в культуре клеток из ИПСК уже разработана для нескольких видов млекопитающих, однако эффективность для разных видов различается, и для каждого вида протокол необходимо адаптировать заново.
На спасение северного белого носорога BioRescue получил финансирование в размере 4 млн евро от Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF). Команда из Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка Ассоциации Гельмгольца вместе с коллабораторами из Мюнхена, Нидерландов и Японии опубликовала в Scientific Reports статью о создании ИПСК северного белого носорога. В работе участвовал профессор Кацухико Хаяши из Университета Кюсю. В 2016 году Хаяши с коллегами получили яйцеклетки из кожи мышей, искусственно оплодотворили эти клетки и имплантировали их самкам. Мыши, зачатые этим методом, были здоровыми и плодовитыми.
ИПСК могут быть в двух состояниях: наивном (базовое состояние плюрипотентности) и праймированном — «менее» плюрипотентном. Эксперименты со стволовыми клетками, полученными от мышей, показали, что наивные ИПСК особенно успешно превращаются в зародышевые клетки, поэтому именно их стремились получить исследователи.
Линии ИПСК были созданы из образца кожи, взятого у Набире, самки белого носорога, которая жила в зоопарке города Двур-Кралове (Чехия) и умерла в 2015 году в возрасте 31 года. Использовали мини-интронный плазмидный (MIP) протокол на основе двух векторов, coMIP247 и pCXLE-hMLN, которые поддерживают перепрограммирование различных типов клеток, включая клетки крови взрослого человека. Конструкция CoMiP несет кодон-оптимизированные последовательности канонических факторов перепрограммирования (Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc) и короткую шпилечную РНК для подавления p53, pCXLE работает по такому же принципу, только с другими факторами: Oct, Sox2, NANOG, и LIN28.
После перепрограммирования клеток три независимые колонии размножили и криоконсервировали. Примерно 15% колоний в среде mTeSR1 демонстрировали устойчивый рост и морфологию недифференцированных клеток, которые поразительно напоминали праймированные человеческие ИПС.
Далее ученые проверили, можно ли изменить состояния на наивное, с помощью двух протоколов на основе сред RSeT и N2B27. Однако, когда ученые впервые попытались перевести клетки носорога в наивно-подобное состояние, клетки погибли. Поэтому они ввели в клетки носорога ген BCL2, который предотвращает их гибель, и успешно получили наивные ИПСК.
Праймированные и наивные клетки различали с помощью анализа транскриптома, однако, так как нет полных данных о геноме северного белого носорога, в качестве эталона использовали частично аннотированный геном близкородственного южного белого носорога (Ceratotherium simum simum). Методом иммуноокрашивания была проверена возможность дифференциации клеток в зародышевые листки.
Тем не менее, ученые пока не могут перейти к следующему этапу возвращения носорога. Полученные клетки непригодны для производства гамет, так как векторы перепрограммирования интегрировались в их геном. Однако авторы работы предполагают, что плюрипотентность поддерживается независимо от экспрессии трансгенов, а контролируется экспрессией эндогенных факторов, что дает возможность изучать регуляцию плюрипотентности и дифференцировки стволовых клеток носорога. «Например, мы можем изучать, почему период беременности у носорога составляет 16 месяцев, а у мыши всего 21 день, или как развиваются органы у разных видов», — объясняет первый автор статьи Вера Зывица из Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка.
Статья Zywitza et al. Naïve‑like pluripotency to pave the way for saving the northern white rhinoceros from extinction опубликована в журнале Scientific Reports.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru