Биосенсор для выявления клещевого энцефалита
Сибирские ученые разработали биолюминесцентный зонд для определения вирусов
Ученые из Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН совместно с коллегами из Института биофизики СО РАН (г. Красноярск) создали биосенсор, способный распознавать клещевой энцефалит.
Биолюминесцентный зонд представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из двух частей. Одна связывается с вирусом, а вторая служит сигнальной молекулой, которая и позволяет выявить его наличие. «Первый фрагмент биосенсора – это вариабельный домен специфичных моноклональных антител, который контактирует непосредственно с белком вируса, – поясняет старший научный сотрудник ИХБФМ СО РАН кандидат биологических наук Вера Витальевна Морозова. – Второй – люминесцентный белок (люцифераза), полученный в ИБФ».
«Упомянутая люцифераза (в данном случае – мягкого коралла Renilla muelleri) – небольшой одноцепочечный белок, она была клонирована нашей лабораторией фотобиологии, и в нее мы ввели 7 мутаций, в результате которых существенно увеличилась стабильность фермента, – поясняет ведущий научный сотрудник ИБФ СО РАН доктор биологических наук Людмила Алексеевна Франк. Известно, что квантовый выход у биолюминесцентных реакций (катализируемых специфическими ферментами – люциферазами) намного выше, чем у обычных хемилюминесцентных (свечение, сопровождающее некоторые химические процессы – прим.ред.) реакций. То есть, количество света, испускаемое в результате люциферазных реакций больше, и таким образом, люциферазы, используемые как сигнальные молекулы, позволяют выявлять мишени с более высокой чувствительностью.
Обе составляющих соединяются с помощью методов генной инженерии, в результате получается плазмида – генетическая конструкция, содержащая объединенные гены двух белков. Затем она помещается в бактериальные клетки, в которых синтезируется гибридный, достаточно стабильный искусственный белок – его можно выделить из клеток и работать с ним далее.
«Технически весь процесс тестирования выглядит так: берется клещ, размалывается, из него экстрагируется водная часть, которая, может содержать вирус, далее водная суспензия вносится в ячейки, содержащие антитела, – объясняет младший научный сотрудник ИХБФМ СО РАН кандидат химических наук Иван Константинович Байков. – В случае, когда последние связали вирус клещевого энцефалита, происходит его накопление, что затем выявляется добавлением биолюминисцентного зонда и последующей химической реакцией люминесценции. Если вируса клещевого энцефалита нет, то антитела остаются пустые, сигнала не будет».
Выявить клещевой энцефалит в крови сложнее, он присутствует там недолго, а потом проникает в нервную систему, так что основное применение зонда – экспресс-проверка клещей, переносящих заболевание.
Если говорить об аппаратной части, то для выполнения анализов необходим люминометр, с помощью которого регистрируются кванты излучения от люциферазной части биосенсора.
Ученые проверили клещей, предварительно зараженных вирусом с определенным титром одновременно в коммерческих тест-системах и с помощью созданного зонда. «Преимущество этой разработки – более высокая чувствительность, она позволяет выявить даже незначительное количество вируса клещевого энцефалита, – отмечает Иван Байков. – Для внедрения в практику нам нужно провести еще ряд экспериментов, выявить, какие примеси могут мешать, оптимизировать протокол пробоподготовки и непосредственно прототип тест-системы».
По такому же принципу можно разрабатывать зонды и для детекции других вирусов: точно так же взять нужное антитело и объединить по уже известной технологии с биолюминисцентным белком.
«Это касается и бактериальных или грибных агентов, – комментирует Вера Морозова. – Сейчас мы пытаемся получить тест-системы на выявление патогенных грибов, часто встречающихся у иммуносупрессивных пациентов».
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
12.04.2016