Как образуется меланома

Генотипирование индивидуальных меланоцитов кожи выявило пути их злокачественной трансформации

Вячеслав Калинин, «Элементы»

Рис. 1. Схема обсуждаемой работы. Слева – эпидермис человека состоит из нескольких типов клеток, но подавляющее большинство из них – кератиноциты разной степени «зрелости». Древовидные меланоциты в основном распределены по одиночке в базальном слое эпидермиса. При помощи своих разветвленных отростков они распределяют пигмент меланин по окружающим кератиноцитам для защиты от солнечного ультрафиолета. Справа – ученые выделяли индивидуальные меланоциты из образцов кожи доноров, подращивали их в культуральной среде до образования небольших колоний, а затем проводили амплификацию и полное секвенирование геномов. Параллельно проводили амплификацию и секвенирование РНК. Результаты сопоставляли, и истинными мутациями признавали только те, которые обнаруживались и в ДНК, и в РНК. Анализ этих мутаций позволил установить, какие из них приводят к злокачественной трансформации меланоцитов. Рисунок из популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Nature.

Меланомы относятся к самым агрессивным и смертоносным формам рака. При этом ученые пока знают очень мало о ранних стадиях формирования меланомы. Один из способов разобраться с этим – проследить за тем, как копятся мутации в отдельных меланоцитах (клетках эпидермиса, отвечающих за пигментацию кожи). Американские ученые разработали для этого новый метод, который позволил с минимумом ошибок сравнить геномы индивидуальных меланоцитов с разных участков кожи нескольких доноров. Как и следовало ожидать, в фенотипически нормальных меланоцитах, регулярно подвергавшихся мутагенному действию солнечных лучей (например, с лица или шеи), накапливалось больше мутаций, чем в меланоцитах, взятых с почти всегда защищенных от солнца участков тела. Но неожиданно оказалось, что меланоциты с рук, бедер или спины (участков кожи, которые получают в течение жизни промежуточную дозу солнечного ультрафиолета) имели еще больше мутаций. Установлено, что в нормальных меланоцитах есть много мутаций, считающихся онкогенными, но среди них нет «сильных» онкогенных мутаций, свойственных меланомам. Также ученые представили общую схему путей дополнительного мутагенеза, превращающего нормальные меланоциты, несущие «слабые» мутации, в злокачественные, из которых впоследствии развиваются меланомы.

Эпидермис – внешний и самый тонкий (его толщина всего около 0,1 мм) слой кожи человека. В основном (примерно на 90%) он состоит из кератиноцитов. Эти клетки появляются в самом глубоком – базальном – слое эпидермиса в результате дифференциации стволовых клеток (благодаря чему кожа постоянно обновляется). Основные функции кератиноцитов – защитная и структурная. В течение своей жизни (которая длится 1,5–2 месяца, см. K. M. Halprin, 1972. Epidermal „turnover time“ – a re-examination) кератиноцит смещается к внешней границе эпидермиса. При этом он постепенно уплощается и, если выразиться совсем кратко, «твердеет». Достигнув поверхности кожи кератиноцит, представляет собой уже всего лишь роговую чешуйку, которая довольно быстро отшелушивается, уступая место следующим.

Другой важный тип клеток эпидермиса – меланоциты. Они производят пигмент меланин, отвечающий за цвет нашей кожи. При помощи меланосом меланин распределяется по окружающим кератиноцитам и запасается в них, выполняя свою роль – защищать клетки кожи от ультрафиолета (в первую очередь – солнечного). В норме меланоциты живут в базальном слое эпидермиса.

В течение жизни в соматических клетках организма возникают и накапливаются случайные мутации. В результате в каждой клетке формируется уникальный набор мутаций. Абсолютное большинство этих мутаций нейтральны и не оказывают какого-либо значительного влияния на качества клетки, но некоторые могут затронуть ключевые гены, контролирующих поведение клетки, и направить ее по пути злокачественного перерождения – неконтролируемого деления, в результате которого возникают раковые опухоли.

Основным фактором, провоцирующим раки кожи, является ультрафиолетовая область солнечного света. Клетки эпидермиса, призванные защищать организм от УФ-излучения, от него же и страдают. Отчасти это воздействие нивелируется постоянным обновлением кератиноцитов. Но с возрастом мутации все равно копятся, а риск развития онкологических заболеваний растет. И если раковые опухоли, происходящие из кератиноцитов (например, базалиомы и сквамозно-клеточные карциномы), лечатся весьма успешно, то с меланомами, возникающими из меланоцитов, дело обстоит гораздо хуже. Меланомы весьма агрессивны, склонны рано образовывать метастазы в отдаленных органах и тканях, и поэтому часто заканчиваются летальным исходом. Ранняя диагностика меланомы осложняется тем, что на начальных стадиях развития опухоли она похожа на безобидные родинки, образованные локальным разрастанием нормальных меланоцитов. Меланомы тоже, как правило, вызываются солнечным ультрафиолетом, но это не единственная причина. Например, некоторые родинки могут перерождаться в опухоль, если в них произойдут определенные мутации, не связанные с УФ-облучением. По степени накопления связанных с солнечным облучением повреждений (cumulative sun damage, CSD) ВОЗ делит меланомы на два основных подтипа: с низким уровнем CSD (low-CSD) и с высоким уровнем CSD (high-CSD). И те, и другие являются очень агрессивными и часто смертельными.

В кератиноцитах работает специальная программа, зависящая от белка р53. После облучения большой дозой ультрафиолета она запускает апоптоз, приводящий к отслаиванию участков эпидермиса после, например, ожога солнечным ультрафиолетом. Ген TP53, кодирующий этот белок, тоже может повредиться из-за мутаций. Клоны кератиноцитов с мутантным TP53, несмотря на постоянное обновление кожи, могут оставаться в ее структуре и потенциально развиться в рак. Такова в общих чертах схема развития опухолей из кератиноцитов.

В то же время механизмы, приводящие к началу злокачественной трансформации меланоцитов в меланомы, не известны даже в такой степени. Расшифровка того, где именно происходят мутации и с какой скоростью они копятся в предраковых меланоцитах нормальной кожи, может дать важную информацию о ранних стадиях трансформации – до того, как станет очевидной неопластическая пролиферация и превращение нормальных клеток в раковые и их неконтролируемое размножение. Именно такую задачу попытались решить американские ученые под руководством Хантера Шэйна (A. Hunter Shain) из Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Ранее неоднократно предпринимались исследования онкогенных мутаций на небольших фрагментах различных органов и тканей, в том числе кожи (см., например, I. Martincorena et al., 2015. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin). Для меланоцитов такой подход невозможен, так как они представлены редкими вкраплениями среди кератиноцитов, и требуется проводить генотипирование на отдельных клетках. Но прямое секвенирование генома индивидуальных клеток требует предварительной амплификации клеточной ДНК, и при этом обычно теряются большие фрагменты генома и накапливается много ошибок, неизбежных при амплификации даже высокоточными ДНК-полимеразами. Альтернативный подход предусматривает предварительное размножение единичных клеток in vitro с целью увеличить количество анализируемой ДНК. Но при этом возникают мутации, которых не было в исходных клетках. Недостатки этих подходов не позволили использовать в обсуждаемой работе, поскольку ученые хотели как можно точнее определить разницу в мутагенезе между отдельными меланоцитами. В итоге ученые совместили оба подхода, чтобы взять из каждого лучшее.

В экспериментах использовались 19 небольших фрагментов нормальной по морфологии кожи от шести уже скончавшихся доноров европейского происхождения в возрасте от 63 до 85 лет. У двоих из них был рак кожи, у четверых – нет. Всего было исследовано 133 меланоцита. Фрагменты брали из разных по степени подверженности солнечному излучению участков кожи. К участкам с высоким уровнем облучения относили, например, лицо, шею и кожу головы у лысых людей; к участкам со средним уровнем облучения – кожу спины и бедер; к участкам с низким уровнем – кожу с тех частей тела, которые почти всегда скрыты под одеждой у большинства людей. Полученные из кожи клетки эпидермиса немного подращивали в культуральной среде, выделяли из них индивидуальные меланоциты и культивировали их лишь кратковременно, сводя к минимуму возможность возникновения дополнительных мутаций. При культивировании 38% выделенных меланоцитов образовали небольшие колонии (от 2 до 3000 клеток, в среднем – 184). Большинство из них были достаточного размера для дальнейшего анализа. Из колоний меланоцитов выделяли, амплифицировали, секвенировали и ДНК, и РНК. Это позволило получить и сопоставить и генотип (ДНК), и проявляющийся фенотип меланоцитов (РНК), исключая ошибки амплификации. Дополнительным критерием для элиминации ошибок служило наличие нормальных полиморфизмов структуры ДНК (нейтральных вариаций нуклеотидной последовательности) вблизи предполагаемых мутаций (рис. 2).

Рис. 2. Методы, которыми ученые отделяли истинные мутации от артефактов амплификации. Сначала выделялись только те мутации, которые обнаруживались и в ДНК, и в РНК (слева). Затем, для дополнительной проверки истинности мутаций, ученые определяли, с какими однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) они связаны (справа) – проверку проходили только те мутации, которые однозначно соответствовали конкретным вариантам полиморфизма. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature.

По результатам секвенирования ДНК и РНК для каждого клона сравнивали результаты по 509 генам, наиболее часто встречающихся в различных злокачественных опухолях, считая их онкогенами, которые могут быть связаны и с меланомой. В среднем частота мутаций составляла 7,9 на мегабазу (МБ), но эта величина сильно варьировала: разброс был от менее чем 0,82 до 32,3 мутации на МБ.

Как и ожидалось, меланоциты из наиболее защищенных от солнца участков кожи имели значительно меньше мутаций, чем из «наиболее облученных». Но неожиданно оказалось, что меланоциты с «промежуточной» дозой облучения имеют еще больше мутаций (рис. 3, слева).

Рис. 3. Слева – меланоциты, взятые с участков кожи, которые нерегулярно подвергаются воздействию солнечного ультрафиолета (например, кожа бедер или спины; intermittently sun exposed), имели больше мутаций, чем меланоциты как с наиболее подверженных облучению участков кожи (лицо, шея; chronically sun exposed), так и с наиболее защищенных (область паха; sun shielded). Справа – некоторые меланоциты из участков здоровой кожи вблизи меланомы могли иметь больше мутаций, чем клетки самой меланомы. Графики из обсуждаемой статьи в Nature.

Достоверного объяснения этому наблюдению пока нет. Возможно, оно связано с разной скоростью мутирования в геномах меланоцитов различных частей тела или с их ускоренной гибелью и возобновлением на экспонируемых на солнце частях тела. Но оно хорошо согласуется с известным фактом, что меланомы на иногда экспонируемых на солнце частях тела возникают непропорционально чаще по сравнению с другими формами рака кожи.

Частота мутаций у различных доноров сильно варьировала. Более того, в образцах от доноров, болевших раком кожи, наблюдалось следующее: в некоторых меланоцитах из участков здоровой кожи, прилежащих к меланоме, частота мутаций была заметно выше, чем в меланоме как таковой (рис. 3, справа). Такую ситуацию нельзя назвать типичной. Например, при колоректальных раках частота мутаций в опухолях намного выше, чем в прилежащих тканях.

Еще одной неожиданностью стал большой разброс в частоте мутаций в индивидуальных меланоцитах, выделенных из одного маленького (площадью примерно 3 см²) участка кожи. Чтобы найти причины этих различий, ученые сравнили уровни экспрессии ряда генов в таких меланоцитах. Наиболее убедительная корреляция была получена для гена MDM2, продукт которого вызывает деградацию главного противоопухолевого и противомутационного белка р53. В меланоцитах с усиленной экспрессией MDM2 наблюдалось достоверно больше мутаций, чем в их соседях с нормальным уровнем. Но возможные причины указанных различий различным уровнем экспрессии MDM2 не ограничиваются, и для раскрытия этих причин требуются дальнейшие исследования.

Сравнение набора мутаций в меланомах и меланоцитах из соседних с опухолями участков нормальной кожи выявило их существенные различия. Следовательно, заключили исследователи, клетки опухоли не «перескакивают» в участки окружающей их кожи и наоборот.

Далее авторы проанализировали возникновение в меланоцитах мутаций, для которых ранее была показана их роль как драйверов злокачественного перерождения клеток при других раках. Большинство таких мутаций было связано с сигнальным путем МАРК, управляющего выживанием, активацией подвижности и, главное, активацией деления клеток. Но в основном это были так называемые «слабые» онкогенные мутации. Так, среди них не было очень часто встречающейся в меланомах «сильной» мутации BRAFV600E – главного драйвера развития low-CSD меланом. Мутации, найденные в нормальных меланоцитах, являются сравнительно слабыми активаторами пути МАРК и не могут быть активными драйверами онкогенеза. Для формирования high-CSD меланом, для которых они свойственны, нужны дополнительные мутации-драйверы.

Рис. 4. Схема возможных путей возникновения меланомы. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature.

Также были обнаружены мутации в генах, контролирующих клеточный цикл, и в генах, контролирующих модификации хроматина. Как таковые эти мутации не могут самостоятельно индуцировать неопластический процесс, но могут ускорить его в клетках с мутациями в генах пути МАРК. Примечательно, что в меланоцитах не было найдено мутаций в промоторе гена TERT (обратной транскриптазы, компонента теломеразы). Несмотря на то, что такая мутация часто встречается в меланомах, она вряд ли как-то стимулирует процесс неопластической трансформации меланоцитов.

Полученные результаты представляют собой чрезвычайно подробные данные по структуре геномов нормальных меланоцитов. Также они позволили получить детальную информацию по мутагенезу, вызываемому солнечным ультрафиолетом, и о путях возникновения меланом. Разработанный методической подход для анализа геномов индивидуальных меланоцитов может быть использован для анализа геномов индивидуальных клеток других органов и тканей.

Источник: Tang et al., The genomic landscapes of individual melanocytes from human skin // Nature. 2020.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru