Первый искусственный бактериальный геном

Летом 2007 г. институт знаменитого Крейга Вентера закончил работу по созданию первой в мире «рукотворной» бактерии, Mycoplasma laboratorium – вернее, пока не самой бактерии, а ее ДНК, и подал патентную заявку на набор генов, достаточный для создания свободноживущего, способного к самостоятельному росту и размножению микроорганизма, обладающего минимальным набором генетического материала.

Вчера СМИ снова вспомнили о Синтии (Synthia – так окрестили будущее достижение синтетической биологии): в on-line версии журнала Science вышла статья 17 исследователей из Института Крейга Вентера (J. Craig Venter Institute, JCVI) с описанием технологии изготовления искусственной бактериальной хромосомы.

Эта работа, проведенная под руководством доктора Carole Lartigue, является вторым из трех ключевых шагов на пути к основной цели авторов – созданию полностью искусственного микроорганизма. Сейчас ученые уже приступили к последнему этапу – попытке создания на основе синтезированного ими генома рукотворной бактерии. Они намерены внедрить искусственный геном в живую бактериальную клетку и таким образом превратить ее в первую созданную человеком бактерию.

Вентер полагает, что спроектированные геномы обладают огромным потенциалом. Синтетические бактерии могут оказаться более пригодными для микробиологического синтеза, чем используемые сейчас микроорганизмы, выведенные с помощью селекции и мутаций или генной инженерии. С другой стороны, есть учёные, которые считают его претензии излишне драматизированными и больше рассчитанными на публику, а поставленных Вентером целей (синтез различных веществ, в т.ч. получение биотоплива, поглощение углекислого газа из атмосферы) можно добиться и традиционными методами генных манипуляций, не прибегая к громкому лейблу «Жизнь 2.0» и синтезированным ДНК. Но грандиозная научная ценность этой работы сомнений у специалистов не вызывает.

Крупнейшая на сегодняшний день искусственная ДНК (ранее синтетическим путем было получено несколько вирусов; один из них тоже сделан в JCVI) – это ровно 582970 пар нуклеотидных оснований, составляющих 381 ген – минимальный набор, достаточный для жизни «в пробирке».

Исследователи блестяще решили стоявшую перед ними задачу путем химического синтеза фрагментов ДНК и разработки новых методов их сборки и воспроизведения. Специалисты считают, что со временем разработки авторов найдут широкое применение в развивающейся области синтетической геномики.

Синтезировать хромосому из строительных блоков ДНК – нуклеотидных оснований: аденина (А), гуанина (Г), цитозина (Ц) и тимина (Т) химическими методами достаточно сложно. По мере удлинения нити ДНК во время синтеза одновременно повышается ее хрупкость, что значительно затрудняет работу. По сравнению с последним рекордом в области синтеза ДНК – нитью ДНК, состоящей из 32000 пар нуклеотидов, – синтетический геном, включающий более 580 т.п.н, является поистине грандиозным достижением.

Методы, применяемые при создании искусственного генома

Перед началом работы, для того, чтобы убедиться, что в качестве шаблона они имеют не содержащую ошибок последовательность бактериальной хромосомы, ученые провели повторное секвенирование генома обычного штамма Mycoplasma genitalium. После получения окончательной версии генома авторы химическими методами синтезировали фрагменты ДНК, из которых впоследствии построили 101 «модуль» размером 5-7 т.п.н.. Для того, чтобы синтетический геном можно было без труда отличить от естественного, в него встроили своего рода «водяные знаки» – короткие последовательности ДНК, кодирующие информацию, не встречающуюся в природе. Еще одним отличием синтетического генома от естественного является отсутствие генов, обеспечивающих инфекционность микроорганизма. При создании модулей авторы сотрудничали преимущественно с занимающейся синтезом ДНК компанией Blue Heron Technology, а также компаниями DNA 2.0 и GENEART.

После этого исследователи разработали 5-ступенчатый процесс последовательной сборки модулей в более крупные фрагменты. На первом этапе объединение четверок модулей позволило получить 25 фрагментов ДНК, каждый из которых состоял примерно из 24 т.п.н. Эти фрагменты клонировали в бактериях Escherichia coli (кишечной палочки, одной из главных рабочих лошадок молекулярных биологов) для получения количества ДНК, достаточного для проведения последующих этапов и контроля правильности последовательности.

Следующий этап заключался в комбинировании полученных фрагментов в 8 блоков по 72 т.п.н. Эти более крупные фрагменты также клонировали с помощью E.coli, после чего объединили их попарно. В результате получилось 4 крупных фрагмента, каждый из которых содержал около 144000 пар нуклеотидных оснований и представлял собой четвертую часть генома микоплазмы.

На этом этапе работы авторы обнаружили, что клетки E.coli не могут синтезировать фрагменты ДНК необходимого им размера и, в поисках замены, обнаружили, что дрожжи способны не только клонировать крупные фрагменты ДНК, но и объединять их между собой с помощью механизма гомологичной рекомбинации. В результате четвертинки генома были успешно объединены в одно целое, содержащее более 580 000 пар нуклеотидных оснований. Полученную хромосому снова секвенировали для подтверждения точности химической структуры.

Синтетическая хромосома M.genitalium JCVI-1.0 имеет молекулярную массу 360,110 килодальтон (kDa). Напечатанная на бумаге шрифтом в 10 пунктов последовательность синтетической хромосомы занимает 147 страниц.

Ключевые этапы работы по созданию искусственного генома

Корни идеи синтеза искусственного организма уходят в середину 90-х годов, когда после секвенирования генома M.genitalium Вентер и его коллеги запустили проект «Минимальный геном». Целью работы была идентификация минимального количества генов, необходимых для обеспечения жизнедеятельности независимого организма. Объектом исследования закономерно стала M.genitalium, обладающая самым маленьким геномом среди известных человеку организмов, пригодных для выращивания в культуре. Результаты работы были опубликованы в 1995 году в журнале Science.

В 2003 группа исследователей сделала первые значительные шаги в направлении создания искусственного генома. Ученым удалось синтезировать последовательность ДНК бактериофага ΦX174 (phi X), состоящую из 5386 пар нуклеотидных оснований. Для этого они использовали коммерчески доступные искусственные одноцепочечные нити ДНК (олигонуклеотиды), которые объединяли с помощью модификации метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), получившей название полимеразной цикличной сборки (polymerase cycle assembly, PCA). На создание искусственного бактериофага у исследователей ушло всего 14 дней.

Этические вопросы

С самого начала работы в области синтетической биологии Вентер и его коллеги осознавали, что их действия вызовут массу вопросов со стороны общественности. Но группа экспертов по биоэтике из университета Пенсильвании в результате анонимного голосования постановила, что до тех пор, пока исследователи выносят предпринимаемые ими действия на рассмотрение общественности, причин для прекращения работы в выбранном ими направлении не существует.

Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru по материалам ScienceDaily.

25.01.2008