О развитии нанобиотехнологии

Статья опубликована в журнале «Инновации» № 12-2007

О развитии  нанобиотехнологии

М.П.Кирпичников, К.В.Шайтан

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова
Биологический факультет, Москва 119991, Ленинские горы, д.1, стр.12

В статье кратко изложены некоторые из актуальных направлений современной нанобиотехнологии. Внимание уделено вопросам адресной доставки лекарств, диагностике заболеваний, биосовместимым материалам и материалам на основе белков паутины, наноустройствам и нанороботам, самосборке нанобиоструктур, молекулярному моделированию и компьютерному дизайну нано- и биоструктур, потенциальным биологическим рискам, возникающим при использовании наночастиц и наноматериалов, проблемам подготовки кадров для нанобиоиндустрии и биоинженерии.

В настоящее время во всем мире значительное внимание уделяется развитию нанотехнологий, происходит формирование организационных структур и выбор приоритетов. В нанотехнологиях представлен широкий спектр научных достижений, имеющий выходы в самые разные производства и сферы деятельности. Набрав, например, на сайте Google слово  «nano» мы получим около 70 млн. ссылок.

На слово «nanobio» число ссылок порядка 176 тысяч. Поэтому в предлагаемой вниманию статье мы лишь кратко коснемся некоторых вопросов нанобиотехнологии, т.е. раздела нанотехнологий, который связан с биологией и медициной. Ниже дан очень краткий обзор отдельных направлений нанобиотехнологии, по которым, по нашему мнению, в России уже имеется существенный задел и где можно ожидать создания конкурентоспособных технологий и продукции. Учитывая общий информационный характер статьи, мы принципиально отказались от ссылок на какие-либо специальные научные работы.

Дополнительная информация общего плана может быть найдена, например, в Интернете с использованием поисковых систем.

На рис.1 представлен далеко не полный спектр направлений развития нанобиотехнологии, которые, как мы полагаем, являются весьма перспективными. 

рис.1. Некоторые перспективные направления развития нанобиотехнологии.

 1.  Адресная доставка лекарств

Одной из областей интенсивного развития нанобиотехнологии в приложении к биомедицине является разработка новых методов селективной внутриклеточной и внутритканевой доставки физиологически активных веществ. Основная идея адресной доставки показана на рис. 2.

рис.2. Наноконструкции для селективной внутриклеточной доставки лекарств.

Здесь имеется несколько направлений. Ряд наноразмерных форм углерода (фуллерены, нанотрубки) обладают хорошей проникающей способностью по отношению к биомембранам и, что весьма важно, оказываются способными преодолевать гематоэнцефалический барьер и являться транспортерами для лекарственных препаратов.

Проведенные, в частности, в МГУ им. М.В.Ломоносова предварительные исследования трансмембранного транспорта наноструктур и их комплексов с биополимерами показывают принципиальную возможность создания наноустройств (наномашин) для селективного распознавания рецепторных участков на поверхности клетки и доставки в них активных субстанций, что в перспективе способно расширить терапевтические возможности лечения онкологических заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, нейроинфекций и др. и резко снизить терапевтические дозы лекарств, минимизировав побочные эффекты.

Важное направление связано с микро- и нанокапсулированием биологически-активных веществ (БАВ) на основе биодеградируемых полимеров, а также с использованием липосом. Разработка этой технологии проводится рядом институтов РАН, РАМН и МГУ, что позволит в перспективе создать принципиально новые лекарственные препараты с контролируемым терапевтическим воздействием на определенные ткани и органы. Эта технология применяется для создания эффективных лекарственных систем контролируемого выведения инкапсулированных БАВ: лекарственных препаратов (в том числе нерастворимых в воде или нестабильных), пептидов и белков (имеющих функции гормонов и цитокинов), а также генетических конструкций, несущих гены ферментов, гормонов и цитокинов.

Прогресс в развитии синтеза биодеградируемых полимеров, технологии нанокапсулирования, а также методов клеточной и молекулярной физиологии и патофизиологии позволит использовать технологию создания систем контролируемого выведения БАВ на основе наночастиц из биодеградируемых полимеров для лечения раковых заболеваний, гормональных расстройств различной этимологии, атеросклероза, диабета, туберкулеза и других социально значимых болезней, а также для генной терапии широкого спектра заболеваний.

Технология включения лекарственных веществ в нанокапсулы позволит использовать многие лекарственные соединения, доставка которых в органы и ткани была бы сильно затруднена из-за их нерастворимости в воде или нестабильности; эта технология позволит снизить токсичность и добиться желаемой фармакокинетики для лекарственных препаратов. Нанокапсулирование белков и нуклеиновых кислот позволит создавать системы доставки в различные ткани организма пептидных гормонов, цитокинов и генетических конструкций. Разработка способов присоединения к наночастицам лигандов направленного действия поможет доставлять биологически-активные вещества в определенные ткани.

Важным моментом является также изучение транспорта нанообъектов металлической и полупроводниковой природы, а также суперпарамагнитных наночастиц для селективного разрушения клеток при электромагнитном разогреве, что важно для лечения ряда опухолей.

2. Нанодиагностика патологических состояний и инфекций, нанобиосенсоры

Успехи последних лет в описании функционирования генома человека, молекулярных механизмов клеточных процессов обеспечивают основу для существенного  повышения информативности медицинской диагностики. Вместо контроля немногих соединений, традиционно трактуемых как характерные маркеры для той иной болезни, становится возможным получать надежные и информативные сведения о функционировании организма и развитии патологического процесса на основании комплексного учета уровня значительного числа соединений, тем или иным образом связанных с патологическим процессом.

В связи с этим представляется крайне важным снизить трудоемкость получения диагностически значимой информации, обеспечив тем самым возможность массового применения новых методов. Необходимые меры по обеспечению эффективности анализа должны включать сокращение объемов проб, применение единых протоколов проведения анализа, сокращение его длительности и автоматизированную регистрацию результатов.

На сегодняшний день среди разработок в этом направлении доминирует создание микрочипов, в которых флуоресцентная метка, химически конъюгированная со специфическими реагентами, связывается с определенными участками подложки-носителя. Возможности анализа существенно расширяются при использовании в качестве детектируемых маркеров коллоидных наночастиц.

Варьирование состава и размеров наночастиц золота, серебра и других металлов позволяет сформировать ряд маркеров с различными спектрами поглощения. Еще большее разнообразие маркеров обеспечивается при использовании так называемых квантовых точек (quantum dots) – флуоресцирующих наночастиц на основе кадмия, цинка и других металлов. Квантовые точки с разным диаметром частиц (достигаемым посредством модификации условий синтеза) охватывают весь видимый спектр излучения, создавая эффективную основу для проведения мультианализа.

Таким образом, применение наночастиц для мечения специфических комплексов определяемого соединения (например, с помощью иммобилизации на их поверхности специфических антител) позволяет одновременно количественно определять содержание в тестируемой пробе различных соединений. Принципиальной особенностью этого подхода является возможность определять несколько соединений в одной пробе. Это позволяет не просто сократить объем пробы, но и проводить дифференциальную детекцию структурно близких соединений, способных связываться с одними и теми же рецепторными элементами.

Существенными диагностическими возможностями обладает атомно-силовая микроскопия (рис.3,4), используемая для детектирования комплексов биомакромолекул,  например, белок-антитело.

Рис.3. Детекция комплексов антиген-антитело АСМ

рис.4. Изображения антител в свободном состоянии и иммунных комплексов, полученные с помощью атомно-силового микроскопа.

Для создания высокочувствительных биосенсоров перспективна также технология, использующая биополимерные функциональные плёнки в состоянии гидрогеля. Формирующаяся у них поверхностная архитектура имеет большие преимущества для использования в качестве биосенсоров в связи с чувствительностью к изменению внешних параметров среды, биосовместимостью, возможностью селективного захвата ДНК.

3. Наноструктурированные биосовместимые материалы

Имеющиеся экспериментальные и клинические исследования показывают, что плазмонапыленные покрытия на поверхности имплантатов хорошо стимулируют остеоинтеграцию и являются весьма эффективным решением проблемы отторжений имплантатов. Однако, покрытия на имплантатах должны обладать комплексом часто взаимоисключающих свойств: высокой адгезией, пористостью, развитой морфологией, хорошей биосовместимостью.

Эти условия достигаются применением слоистых наноструктурированных покрытий. Известно, что формирование заданных свойств материалов возможно путем создания условий образования самоорганизующихся структур нанодиапазона. Однако, применительно к процессам плазменного напыления биопокрытий на имплантаты  условия формирования наноструктур мало изучены. Между тем переход на новый уровень взаимодействия искусственных (имплантат с покрытием) и естественных (костная ткань) материалов позволил бы качественно улучшить процесс остеоинтеграции имплантатов и повысить биологичность контакта имплантата и костного ложа.

Поэтому важно совершенствовать методы и технологии получения биопокрытий, а также находить новые способы формирования заданных свойств материалов. Необходимо также совершенствовать исследовательские комплексы для получения достоверной базы знаний о таких сложных многофакторных процессах путем изучения влияния на механические и физико-химические свойства формируемых покрытий наноструктурных образований.

Большой интерес представляют биосовместимые материалы на основе белков паутины пауков-кругопрядов (спидроин 1 и спидроин 2), которые формируют в железах паука волокна, состоящие из нанофибрил. Эти молекулярные конструкции, отобранные Природой в процессе эволюции способны подсказать нам удачные решения многих технических проблем. Паутинное волокно обладает уникальными свойствами и обладает огромным инновационным потенциалом в самых различных областях промышленности.

Вязкоэластичные нити каркасного шелка пауков обладают одновременно высокой прочностью на разрыв, превышающей сталь и сопоставимой с кевларом, и высокой эластичностью. Это приводит к очень высоким значениям энергии разрыва, по которым этот материал не имеет аналогов среди других природных и искусственных материалов.

Белки паутины имеют очень интересную структуру. Имеется чередование гидрофильных и гидрофобных сегментов, что крайне важно для обеспечения растворимости и регулирования агрегации молекул, которая ведет к формированию нанофибрилл, а именно наличие нанофибрилл беспечивает наличие уникальных механических свойств этой  нити.

Молекулярное моделирование структуры нанофибрил, проведенное на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ показало, что высокая энергия разрыва обусловлена, по-видимому, формированием суперспиралей из бета-слоев богатых полиаланиновыми вставками спидроинов (рис. 5).
рис.5. Формирование суперспирали из бета-слоев полиаланиновых фрагментов спидроинов.

Есть  первые результаты, которые свидетельствуют о  принципиальной возможности получения на основе рекомбинантных аналогов белков паутины искусственных нитей и пленок, по своим свойствам сопоставимых с природными нитями, а также о возможности разработки технологии создания биосовместимых материалов с уникальными свойствами.

4. Молекулярные машины, самосборка нано- и нанобиоструктур, молекулярное моделирование и дизайн функциональных наноструктур и их комплексов с биополимерами

Сейчас все чаще говорят о наномире, о закономерностях наномира, о его практическом использовании. Хотелось бы подчеркнуть большую общность наномира. В частности, основные «кирпичики», из которых построены живые организмы являются яркими представителями этого наномира. Ферменты, рецепторы, ионные каналы, ДНК, РНК, рибосомы, молекулярные моторы и множество других составляющих клетки и организма в целом являются  в смысле своего размера наночастицами, но при этом чрезвычайно «умными» и с функциональной точки зрения очень рационально сделанными нанообъектами.

Несколько слов о возможностях нанобиотехнологии для молекулярной электроники. Биоэлектроника или био-оптоэлектроника как раздел молекулярной электроники пытается применить биоструктуры, в первую очередь белки или их модифицированные аналоги, в качестве управляемых светом модулей компьютерных и оптических устройств. Основное требование к биологическим модулям (чипам) состоит в том, что в ответ на физическое воздействие — свет они должны обратимо изменять свою конформацию и образовывать, по крайней мере, два дискретных состояния. Эти состояния должны различаться легко измеряемыми параметрами, например спектрами поглощения.

Наиболее вероятными кандидатами на роль таких чипов являются светочувствительные мембранные белки, инициирующие и обеспечивающие работу сложнейшей молекулярной «машинерии» двух основых фотобиологических процессов – зрения и фотосинтеза. Конкретно, речь идет о молекулах зрительного пигмента родопсина и бактериородопсина – белка из галофильных микроорганизмов.

Оба эти белка обладают фотохромизмом и могут рассматриваться как основа для создания фотохромных материалов (чипов) био-оптоэлектроники.

Бактериородопсин, в отличие от других биологических структур, имеет достаточно высокую тепловую и химическую стабильность, чтобы стать первым, но отнюдь не последним, светочувствительным материалом биологического происхождения, пригодным для промышленного применения в оптоэлектронных устройствах.

Впечатляющим примером тому может служить недавнее сообщение о разработке принципиально нового носителя информации, который позволяет записывать на обычный лазерный диск до 50 терабайт информации, то есть приблизительно в десять тысяч раз больше чем на традиционный DVD. Этим новым носителем информации является бактериородопсин.

В качестве ячейки, хранящей один бит информации, используется два состояния бактериородопсина, которые могут переходить одно в другое под действием света определенной длины волны. При этом речь идёт не об обычном (дикий тип), а генетически модифицированном бактериородопсине, обладающем исключительно высокой термо- и химической стабильностью. Оба состояния молекулы бактериородопсина могут сохраняется неограниченно долго – по крайней мере, несколько лет. Это позволяет записывать при помощи лазера на молекулы белка информацию в виде двумерной или линейной последовательности нулей (исходное состояние бактериородопсина) и единиц (продукт его фотопревращения), а затем сохранять и считывать ее.

Принципы организации биологических систем являются весьма эффективными и эволюционно отобранными для создания устройств нанометрового размера с заданной функцией. Объективно, использование этих принципов в нанотехнологиях находится в стадии поисковых разработок.

Вместе с тем, уже сейчас понятно, что проектирование и создание молекулярных машин, использующих энергию химических реакций (или изменения состава среды) для выполнения элементарных функций – фотопереключатели, перемещения молекулярного объекта, создания разности потенциалов, развития тягового усилия является реальной задачей. Это направление является, в частности, приоритетным для европейской программы развития нанотехнологий.

В России накоплен значительный опыт в детальном изучении молекулярных механизмов элементарных биохимических и биофизических процессов (диффузии лигандов, переносе электрона, переносе протона, конформационных перестроек при химических превращениях, фермент-субстратных взаимодействиях, работе ионных каналов и др.), развита динамическая теория электронно-конформационных взаимодействий как основы для функционирования молекулярных машин, развиты основы молекулярного моделирования и дизайна наноустройств.

Широкое признание получили работы по физической теории самоорганизации белковых структур. Это делает весьма вероятным реализацию прорывных работ по созданию молекулярных машин и функциональных наноструктур и получению конкурентных преимуществ в этой области.

В связи с проблемой создания наноустройств, нанороботов и т.п.  нельзя не остановится и на вопросах молекулярного моделирования и молекулярного дизайна нано- и нанобиоструктур. Стремительное развитие компьютерной техники, широкая в ближайшей перспективе доступность суперкомпьютеров и накопление надежных данных о межатомных и межмолекулярных взаимодействиях делает вычислительные эксперименты с нано- и биоструктурами источником объективной информации об их физико-химических свойствах.

Причем получаемый в численных экспериментах уровень детализации процессов с участием наноструктур является максимально подробным. Относительно низкая стоимость вычислительных экспериментов по сравнению с их реальными аналогами делает методы молекулярного моделирования основным инструментом проектирования нано- и нанобиоустройств и структур.

На рис.6 приведен пример самосборки наношприца, состоящего из углеродной нанотрубки и полиаланина. Эта система была предложена для адресной доставки БАВ и рассчитана методами молекулярной динамики на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ. С фундаментальной точки зрения данная система интересна как, фактически, первый пример самосборки функционального нанобиоустройства (нанороботота). Молекула полипептида, адсорбированная на внешней поверхности нанотрубки (закрытой с одного конца) за счет тепловых флуктуаций самопроизвольно упаковывается внутрь нанотрубки в конформации близкой к альфа-спирали.

То есть происходит заряжение наношприца. Если в нанотрубку предварительно была упакована молекула (молекулы), которые при внешнем воздействии распадаются или резко увеличиваю занимаемый объем, то происходит своеобразный «выстрел» и система работает как нанопушка. На рис. 7 показан результат численного эксперимента по воздействию нанопушки на биологическую мембрану: молекула полипептида проникает за короткое время в биомембрану. Обвешивая устье поры нанотрубки лигандами, специфическими к определенным рецепторам на поверхности клетки можно, в принципе, добиться селективности при доставке БАВ (в данном случае полипептида).

5. Потенциальные риски от использования наночастиц и наноматериалов

Нас окружает огромное множество наночастиц, которые являются продуктом обычной человеческой деятельности и большинство из них, по-видимому, относительно безвредны. Вместе с тем, в настоящее время надежно установлено, что в наноразмерном состоянии многие вполне безобидные вещества становятся в биологическом отношении весьма активными и, во многих случаях, сильно токсичными.

Хорошо известны примеры асбеста, оксидов урана, фуллеренов и многих других наночастиц. Однако до сих пор нет систематических исследований о природе токсичности (и канцерогенности) наночастиц, нет сертифицированных технологий определения данного типа токсичности, нет (за редким исключением) соответствующих санитарных и гигиенических норм использования наноматериалов.

На это недавно обратил вниманиеРоспотребнадзор (письмо от 02.06.2007 № 0100/4502-07-32 ).

Отметим основные факторы, обуславливающие потенциальные риски от использования наночастиц и наноматериалов

• небольшой размер и способность проникать через барьеры (в т.ч. гематоэнцефалический)
• большая удельная поверхность
• аномальная реакционная способность (генерация свободных радикалов)
• облегчение проникновения молекул других веществ
• особенности метаболизма (макрофаги «не видят» размеры < 70нм)
• постоянство к накоплению ряда наночастиц.

Вопросы биологических (а также экологических) рисков при использовании наноматериалов  являются важными при прогнозировании эффективности внедрения нанотехнологий. Необходимо также учитывать и возможное влияние наночастиц и наноматериалов на общее состояние дел с обеспечением биологической и химической безопасности как одного из важнейших направлений укрепления национальной безопасности Российской Федерации, изложенных в «Основах государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2010 года и дальнейшую перспективу» (утверждено Президентом Российской Федерации 4 декабря 2003 года № ПР – 2194). Особое значение имеет  химическая и биологическая безопасность в современных условиях ввиду усиления террористических проявлений, которые могут быть направлены на  селективное воздействие на биологические системы и организмы. 

Анализ современного состояния показывает, что, с одной стороны, на основе научных разработок в области нанотехнологии создаются новые «прорывные» эффективные технологии и материалы. С другой стороны, развитие нанотехнологий может привести к созданию нового класса химического и биологического оружия, использующего свойства наночастиц. В настоящее время не существует систематических методов детектирования наночастиц в окружающей среде и биологических объектах.

Поэтому развитие технологий для определения рисков от использования наночастиц и наноматериалов, их сертификации по этому признаку  имеет важнейшее значение не только для развития новых отраслей промышленности, но и сточки зрения обеспечения национальной безопасности. Следует иметь также ввиду, что вопросам нанорисков в последние несколько лет во всем мире стало уделяться пристальное внимание, создаются национальные программы, неправительственные и международные организации по данной проблеме, издается специальный журнал Nanorisk.

Отметим, что вопросы возникающих рисков от использования конкретных наночастиц должны серьезно и методично исследоваться в специальных лабораториях, а непрофессиональные обобщения в этом вопросе не имеют под собой оснований.

В настоящее время на основе разработок ряда институтов РАН, РАМН, МГУ и др. имеются все предпосылки для быстрой и эффективной разработки технологии определения потенциальных рисков от использования наночастиц и наноматериалов.

5. Развитие образовательного компонента по нанобиотехнологии

Развитие нанобиотехнологии, интегрирующей знания и навыки из многих дисциплин в новом сочетании требует проведения определенных мероприятий по подготовке специалистов. Прежде всего, это ориентация на мультидисциплинарное фундаментальное образование, сочетающее наряду с биологическими дисциплинами серьезную подготовку в области химии, физической химии, молекулярной физики, информатики и биоинформатики. Для этого необходимо создание оригинальных спецкурсов, спецпрактикумов, магистерских образовательных программ.

Здесь может быть использован опыт  МГУ им. М.В.Ломоносова, МФТИ и ряда научно-образовательных центров. Так, на биологическом факультете МГУ в рамках Национального проекта «Образование»  разработана инновационная магистерская программа «биоинженер-менеджер».

Одной из задач проекта  «биоинженер – менеджер» является разработка механизма подготовки кадров, находящихся на острие научно-технического прогресса и способных восполнить имеющийся кадровый дефицит. Эта магистерская программа  имеет своей целью подготовку кадров для организации исследований и инновационного процесса в наиболее быстро развивающихся областях биологии, биоинженерии, биотехнологии и нанобиотехнологии.

При этом нужно иметь в виду, что магистратура это лишь первая ступень в формировании высококвалифицированного специалиста. За два года обучения невозможно вложить в него все то, что нужно в современной биоинженерии и нанобиотехнологии. Поэтому важно научить будущего специалиста учиться как современным научным достижениям в выбранной области, так и дать ему организационные и экономические навыки. Для этой цели в рамках подпроекта был разработан достаточно обширный пул спецкурсов и спецпрактикумов, ориентированных на достижение поставленной цели.

Нам представляется целесообразным введение достаточно гибкого учебного плана, в рамках которого была бы увеличена доля предметов по выбору заказчика специалиста. В целом, учитывая серьезные материальные издержки вуза при подготовке специалистов в области современной биоинженерии и нанобиотехнологии, представляется логичным готовить таких специалистов в основном целевым образом по заказам предприятий.

Заключение. 
 
Невозможно в одной статье осветить даже в минимально необходимом объеме проблемы развития нанобиотехнологии. Мы коснулись лишь очень ограниченного круга вопросов, лежащих, что называется, на поверхности. Однако уже сейчас понятно сколь велики и масштабны могут быть последствия прогресса в этой сфере. Сейчас вопросов больше, чем ответов. Но развитие науки в этой сфере происходит  очень быстро.

Велика будет роль фундаментальной науки в понимании общих закономерностей взаимодействия искусственных наноструктур с биологическими объектами. Огромное значение будет иметь инновационный бизнес, аккумулирующий научные достижения и переводящий в нужные конечные продукты.

Роль образования, подготовки кадров как для фундаментальных исследований, так и для инновационного бизнеса трудно переоценить, особенно, в ближайшей перспективе. И уже сейчас понятно, что в этом направлении предстоит очень серьезная работа. Развитие нанотехнологий и, в частности, нанобиотехнологий несомненно будет являться  мощным локомотивом всего прогресса в ближайшие десятилетия.

Об авторах:

• Кирпичников Михаил Петрович, доктор биологических наук, академик, член Президиума РАН, Декан Биологического факультета МГУ, заведующий кафедрой биоинженерии.
• Шайтан Константин Вольдемарович, доктор физико-математических наук, профессор, зам.заведующего кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ.
  
  

Портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru
10.07.2008