07 Февраля 2018

CRISPR-Cas9: еще точнее

Генная терапия является перспективной стратегией лечения заболеваний, вызванных генетическими отклонениями. Все большую популярность приобретает CRISPR-Cas9 – относительно новый метод редактирования генома, работающий по принципу ножниц, которые отсекают дефектные участки ДНК. Потенциал CRISPR-Cas9 сложно переоценить, тем не менее, и он несет в себе ряд нежелательных эффектов, обусловленных ошибками в определении генов, которые необходимо отсечь.

Группа ученых из Университета Осаки (Япония) под руководством Синъитиро Накады (Shinichiro Nakada) сообщила о разработке, модифицирующей CRISPR-Cas9 и существенно снижающей риск ошибки в процессе редактирования.

SNGD.png

Слева: Cas9 перерезает обе нити ДНК, которые восстанавливаются потом в присутствии донорного шаблона. Справа: методика SNGD, при которой частично вырезаются нуклеотиды цепи с геном-мишенью и донорной ДНК.

Метод CRISPR-Cas9 состоит из двух компонентов: белка Cas9, выполняющего роль ножниц и отсекающего дефектный ген, и направляющей РНК, которая указывает белку Cas9, какой именно участок ДНК нужно удалить. Вместе эти два компонента могут удалить любой ген. Проблема в том, чтобы повысить точность CRISPR-Cas9, так как есть вероятность удаления «здорового» гена и сохранения дефектного. Кроме того, в процессе восстановления пересеченной ДНК могут появиться мутации.

Белок Cas9 пересекает обе нити ДНК, разделяя и здоровый ген. Нити довольно быстро восстанавливаются. Механизм восстановления ДНК в клетке основан на копировании поврежденного гена с идентичного участка целой цепи ДНК. Этот участок действует как шаблон, который используется в качестве молекулярного плана, позволяя клетке более точно восстановить ДНК.

Исследователи предложили предоставить клеткам донорный ДНК-шаблон, который повысит точность при восстановлении последовательности азотистых оснований и приведет к репарации ДНК с минимальным риском мутаций. Это позволит с высокой точностью исправить дефектный ген.

Исследователи использовали модифицированную форма белка Cas9 (Cas9-никазу), которая частично пересекала только одну нить ДНК. Одновременное удаление гена-мишени и гена на донорной ДНК привело к повышению точности при восстановлении целостности ДНК и достижению желаемого результата редактирования.

Исследователи выяснили, что разработанная ими техника SNGD (single nicks in the target gene and donor plasmid, одиночный разрез в целевом гене и донорной плазмиде) подавляет формирование нежелательных мутаций по сравнению с традиционной методикой CRISPR-Cas9. В одном из экспериментов уровень ошибок при редактировании техникой CRISPR-Cas9 составила 90%, в то время как при использовании модифицированной методики SNGD он не превысил 5%.

Таким образом, использование донорной ДНК в качестве образца для восстановления генов в сочетании с неполным пересечением ДНК существенно снижают риск мутаций, образующихся в процессе редактирования генома. Важно отметить, что повышение точности не сказалось на производительности метода SNGD.

Статья Kazuhiro Nakajima et al. Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair опубликована в журнале Genome Research.

Аминат Аджиева, портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru по материалам Osaka University: New genome-editing method “cuts back” on unwanted genetic mutations.


Нашли опечатку? Выделите её и нажмите ctrl + enter Версия для печати

Статьи по теме