Терапию болезни Гентингтона с использованием CRISPR-системы опробовали на свиньях
Юлия Панченко, PCR.news
Болезнь Гентингтона вызывает экспансия CAG-повторов в гене гентингтина. Это моногенное заболевание, что делает его привлекательным кандидатом для генной терапии. На сегодняшний день считается, что для лечения необходимо заблокировать экспрессию мутантного гентингтина (mHTT). Для этого использовали малые интерферирующие, короткие шпилечные и микроРНК, которые вирусные векторы доставляют в центральную нервную систему.
В новой работе исследователи из Китая обратились к системе CRISPR-Cas9. Хорошие результаты были получены на мышах, но до сих пор неясно, будет ли система безопасной и эффективной для человека. Для того, чтобы прояснить этот вопрос, авторы предлагают в первую очередь использовать крупных модельных животных, в частности, свиней. Ранее они получили свиней, которые моделируют болезнь Гентингтона и имеют тот же характер нейродегенерации, что и пациенты. Они оценили потенциальное токсическое воздействие системы CRISPR-Cas9 на мозг свиньи и проверили, насколько эффективно система убирает mHTT и нормализует фенотип.
Для доставки системы CRISPR-Cas9 использовали аденоассоциированный вирусный вектор AAV9, который может проникать через гематоэнцефалический барьер. Его же авторы ранее использовали на мышах. Сначала они оценили токсичность Cas9 для мозга свиньи. Для этого вирусный вектор, несущий Cas9 и GFP, стереотаксически вводили в полосатое тело трехмесячных свиней. Через четыре месяца после введения иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что белки распространились в этой области мозга. Уровень экспрессии NeuN не изменился в результате введения вирусного вектора, хотя уровни GFAP и IBA1 были слегка повышены.
Уровни цитокинов в мозге не изменились при введении вирусного вектора. Анализ экспрессии генов в мозге показал, что при введении Cas9 изменился уровень экспрессии 145 генов, а при введении GFP — 219 генов. Интересно, что паттерны экспрессии в двух группах были схожи. Большинство генов были ассоциированы с клеточным ответом на вирусы. Скрининг 20 генов, связанных с воспалением, показал, что инъекция не повлияла на уровень их экспрессии. Анализ еще 185 генов, связанных с иммунитетом, продемонстрировал схожесть паттернов экспрессии между группами, получившими Cas9 и GFP, но не с контролями, что опять говорит о том, что организм реагирует на вирусный вектор, но не на Cas9.
Далее эффективность терапии оценили на свиньях, несущих mHTT. Авторы рассудили, что даже значительное снижение экспрессии HTT не вредило мышам или макакам-резусам, а система CRISPR-Cas9, скорее всего, будет работать как нокдаун, а не полное уничтожение mHTT. Поэтому они взяли гидРНК, которая таргетирует как нормальный, так и мутантный аллели. В качестве ДНК-донора использовали нормальную копию человеческого гена HTT. Систему снова стереотаксически вводили в полосатое тело трехмесячных свиней. К этому возрасту они уже демонстрируют симптомы заболевания.
Через пять месяцев после инъекции исследователи выделили ДНК из полосатого тела мозга свиней, чтобы оценить экспрессию mHTT и человеческой последовательности. Мутантный аллель со 150 повторами частично был заменен на нормальный аллель с 20 повторами. При этом экспрессия mHTT понизилась.
Через четыре месяца после инъекции авторы изучили походку свиней, анализируя их отпечатки на песке. У мутантных свиней шаг был нерегулярным и более коротким. Терапия нормализовала походку свиней. Они также лучше ходили и бегали на беговой дорожке. Одну свинью держали в течение двух лет после введения терапевтического препарата, и ее показатели на беговой дорожке не отличалась от свиней дикого типа. Это говорит в пользу того, что система CRISPR-Cas9 навсегда подавила экспрессию mHTT. Терапия не влияла на массу тела свиней. У авторов создалось впечатление, что мутантные свиньи после терапии жили дольше, чем мутантные свиньи без терапии.
Исследователи проверили, можно ли вводить вирусный вектор внутривенно. Процедуру проводили через 3–7 дней после рождения, когда гематоэнцефалический барьер более проницаем. Через пять месяцев после инъекции вирусный вектор отмечали в разных тканях тела свиньи, включая мозг. Свиньи после терапии экспрессировали меньше mHTT в мозге, чем свиньи без терапии. Их двигательные функции улучшились, как и походка.
У мутантных свиней нейродегенерация характеризуется снижением экспрессии нейронального белка NeuN и повышением экспрессии глиальных белков GFAP и IBA1. Эти изменения обращались вспять после снижения mHTT в результате терапии, независимо от метода введения. У нейронов после терапии была нормальная морфология.
Авторы показали, что замена mHTT на нормальную копию гена происходила не так часто, чаще встречались инделы, снижающие уровень экспрессии mHTT. Нецелевое редактирование происходило редко. Профили экспрессии мозга свиней после терапии были схожи со свиньями дикого типа.
Таким образом, используя большое животное в качестве модели, авторы показали, что одна инъекция вирусного вектора, несущего систему CRISPR-Cas9, в мозг или кровь эффективно снижает нейродегенерацию и нормализует фенотип. Они говорят о том, что полученные результаты подтверждают потенциал системы для терапии болезни Гентингтона и других неврологических расстройств, вызванных мутациями.
Источник: Sen Yan, et al. Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington’s disease // Nature Biomedical Engineering.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru